Optimización de formulaciones liposomales mediante homogeneización a alta presión
Hermida, L.(i); Dománico, R.(i); Sabés, M.(ii); Barnadas, R.(ii)
(i) INTI-Química (ii) Unidad de Biofísica – Universidad Autónoma de Barcelona - España
Introducción
Los liposomas son vesículas lipídicas que se han estudiado como sistemas de vehiculización de fármacos, substancias biológicas y biomoduladores desde hace unos 40 años. Sus componentes son biodegradables, no tóxicos y poco antigénicos. Fundamentalmente permiten resolver problemas de solubilidad, inestabilidad y degradación de las sustancias que transportan, aumentando su biodisponibilidad [1].
Existen numerosos métodos para preparar liposomas, pero la mayoría han sido diseñados para su obtención a nivel laboratorio y resultan difíciles de escalar.
Uno de los métodos más simples y efectivos para la obtención de grandes volúmenes de liposomas es la homogeneización a alta presión. Su funcionamiento se basa en aplicar una gran cantidad de energía a la muestra que provoca la rotura y posterior reensamblaje de las macro estructuras presentes, reduciéndose así su tamaño. La muestra puede ser procesada por ciclos o por recirculación a distintas presiones y temperaturas [2]. La ventaja fundamental frente a otros métodos radica en que los modelos de homogeneizadores más pequeños tienen sus equivalentes a escalas mayores, con lo cual los resultados pueden ser transferidos directamente del laboratorio a la industria.
El objetivo del este trabajo consistió en optimizar la preparación de formulaciones liposomales modelo, mediante homogeneización a alta presión.
Metodología
Preparación de liposomas:
Se emplearon fosfolípidos grado alimenticio. La concentración de lípidos se mantuvo constante a 25 mg/ml. Se incorporó una sonda fluorescente hidrosoluble (HPTS) para la determinación del volumen de sonda incorporado por los liposomas.
Se prepararon tres modelos de liposomas con distinta composición lipídica: —Fosfatidilcolina de soja (SPC) —Fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) —HSPC – colesterol (3:2) molar (HSPC-chol). Los liposomas fueron preparados mediante homogeneización de alta presión, empleando un equipo Microfluidizer 110S escala laboratorio (ver Fig.1), operando en el modo ciclos a temperatura ambiente (SPC) o termostatizando el equipo a 55ºC (liposomas conteniendo HSPC).
Fig. 1: Microfluidizer 110S con sistema de termostatización. Unidad de Biofísica, Universidad Autónoma de Barcelona, España.
Diseño experimental Para cada modelo se trabajó a distintas presiones y número de ciclos de homogeneización (variables x e y), determinándose los diámetros y los volúmenes incorporados para cada caso (variables z). Los parámetros “presión” y “ciclos” se variaron simultáneamente según un diseño experimental del tipo “cuadrado + estrella” (ver Fig.2), en el cual se ensayan por triplicado todos los puntos de la estrella [3]. Se eligió el volumen incorporado como variable cuantitativa por tratarse de una sustancia hidrosoluble, que se localiza preferentemente en el interior acuoso de los liposomas.
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El análisis matemático de los datos permitió obtener los parámetros para cada término de la ecuación que se ajusta al modelo experimental y luego interpolar los valores de presión y/o ciclos adecuados para un diámetro o volumen incorporado determinado.
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retenidos en un alto porcentaje por las columnas de exclusión molecular empleadas y suelen presentar problemas de agregación y/o sedimentación.
La Tabla I muestra las condiciones de preparación seleccionadas para cada tipo de liposoma y los diámetros medios y volúmenes incorporados obtenidos en cada caso.
Presión (bar)
3
2
1
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nº ciclos
Fig. 2: Diseño “cuadrado + estrella” empleado en la optimización.
Los diámetros se determinaron mediante un analizador de partículas Microtrac UPA 150 con un rango de trabajo entre 10 y 1000 nm. El volumen incorporado se determinó separando la sonda liposomada de la libre mediante cromatografía de exclusión molecular y determinando posteriormente el contenido de HPTS por fluorimetría y el de fosfolípidos por el método de Steward [4].
Resultados En la Figura 3 se muestra un ejemplo de superficie de respuesta obtenida para liposomas HSPC-chol, en la que se han determinado los diámetros obtenidos para distintas presiones y Nº de ciclos.
Tabla I. Condiciones “ciclos-presión” seleccionadas para cada formulación. Diámetro medio (en nm) y volumen incorporado (litros/mol de lípido) para las condiciones elegidas.
Modelo de formulación
Liposomas SPC Liposomas HSPC Liposomas HSPC-chol
Ciclos – presión Elegida (Cx Py)
C5 P2,4 C5 P4 C5 P2,4
Diámetro medio (nm)
462 ± 59
859 ± 322
1066 ± 86
Vol. Incorp. (l/mol)
1,54 ± 0,41 0,96 ± 0,17 1,85 ± 0,46
Cabe mencionar que los liposomas conteniendo HSPC fueron procesados a una temperatura de 55ºC debido a los estudios previos sobre la temperatura de transición de fase para este tipo de liposomas (52ºC) realizados mediante calorimetría de barrido diferencial. En cuanto a los liposomas de HSPC-colesterol, a pesar de no presentar la transición, eliminada por la presencia del colesterol, daban lugar a productos inestables físicamente al ser procesados a temperatura ambiente.
Conclusiones
La metodología empleada ha permitido la optimización de la preparación de tres formulaciones liposomales, obteniendo la mayor información con el menor número de ensayos.
En las formulaciones estudiadas, cinco ciclos de homogeneización resultaron suficientes para obtener productos estables, con las características deseadas. En cuanto a las condiciones de presión, los liposomas de HSPC, que presentan transición de fases, requieren la mayor presión de homogeneización (4 bar).
La metodología es aplicable en forma directa a cualquier otro producto obtenido por homogeneización a alta presión, evaluando la influencia de los ciclos y la presión aplicada sobre los parámetros que sean de interés.
Fig. 3: Variación del diámetro (nm) en función de los ciclos de homogeneización y la presión para liposomas HSPC-chol.
De la misma manera, y para los tres modelos planteados, se obtuvieron superficies de respuesta graficando en el eje z el volumen incorporado.
El criterio de selección del procesamiento más adecuado en cada caso fue lograr el máximo volumen incorporado, con diámetros que no superaran ampliamente los 1000 nm. Liposomas de mayor diámetro no resultan adecuados en este caso por varios factores: están fuera del rango de medición de tamaños del equipo empleado, son
Referencias
[1] Allen M. Liposomal drugs formulations. Drugs 56(5):747-756 (1998). [2] Barnadas R. y Sabés M. “Liposomes prepared by highpressure homogeneizers”. Methods in enzymology, Vol.367:28-46 (2003). [3] Deming S. y Morgan S. “Experimental design: a chemometric approach”. Data handling in science and technology Vol3 (1987). [4] Steward J.C.M. “Colorimetric determination of phospholipids with ammnonium ferrothiocyanate”. Analytical Biochemistry 104:10-14 (1980).
Para mayor información contactarse con: Laura Hermida – lhermida@inti.gov.ar
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