TESIS DE MAESTRIA EN CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD INVERTASA EN MIELES DEL DEPARTAMENTO DE CRUZ DEL EJE (CÓRDOBA). TRATAMIENTO TÉRMICO Y POSIBLE ADULTERACIÓN.
Por Ing. Mónica M. Federico
Directora: Dra. Anahí V. Turina Lugar de trabajo
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS Y TECNOLÓGICAS (IIBYT) - FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES - UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL - CENTRO REGIONAL CÓRDOBA Córdoba, Argentina 2021
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
COMISIÓN EVALUADORA
Nombre: Dra. María Verónica Nolan
Nombre: Dra. María Verónica Baroni
Nombre: Mgter. María Clemencia Barberena
Lugar de trabajo: IIBYT (Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas), ICTA (Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos) FCEFyN-UNC, CCT (Centro Científico Tecnológico CONICET-Córdoba)
Lugar de trabajo: ICYTAC (Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos Córdoba), CCT (Centro Científico Tecnológico CONICET-Córdoba)
Lugar de trabajo: Agencia de Extensión Rural, INTA Cruz del Eje.
DEFENSA ORAL Y PÚBLICA
Lugar: Auditorio del Edificio Integrador de la Facultad de Ciencias Químicas – Universidad Nacional de Córdoba Fecha: 16/12/2021 Calificación:
TRIBUNAL
Firma: Firma: Firma:
Aclaración: Aclaración: Aclaración:
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DEDICATORIA
A mi madre, allí donde quiera que esté.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Tecnología Industrial y a sus autoridades por haber financiado esta tesis y brindarme los recursos necesarios para su conclusión.
A la Dra. Sara Eugenia Molina, del Departamento de Alimentos Centro, sede Cruz del Eje de INTI, quién me brindó sus conocimientos, experiencia y realizó los contactos necesarios con la Cooperativa Apícola Villa de Soto para la visita a planta y obtención de las mieles objeto de este estudio.
Al Ing. Agr. Oscar Demarchi, miembro y tesorero de la Cooperativa Apícola Villa de Soto, por su interés en este trabajo y poner a la Cooperativa a mi disposición.
A la Ing. Silvia Ermeninto, jefa del Departamento de Química Analítica y Residuos Urbanos Centro del INTI, y a su equipo de colaboradores quienes me permitieron utilizar las instalaciones y recursos del laboratorio químico.
A la Dra. María Angélica Perillo, quién fuera la directora del IIBYT al momento de iniciar mi tesis, por haber aceptado que realice mi tesis en el IIBYT y poner a mi disposición su personal, laboratorio y recursos para la concreción de esta; y a todo el equipo de profesionales por la colaboración prestada y la confianza recibida.
A las autoridades y docentes de la Maestría, quienes supieron llevar adelante un postgrado de nivel académico.
Y en particular, un agradecimiento sumamente afectuoso, a mi directora de tesis, la Dra. Anahí Turina, que, con su capacidad docente, conocimientos técnicos, disponibilidad constante y paciencia infinita supo orientarme y hacer posible que pudiera lograr los objetivos planteados en esta tesis.
A todos, muchísimas gracias.
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INDICE DE CONTENIDOS
INDICE DE TABLAS
6
INDICE DE FIGURAS
8
ABREVIATURAS
11
RESUMEN
12
1 INTRODUCCIÓN
14
1.1 La miel........................................................................................................................... 14 1.2 Enzima α-glucosidasa (invertasa) y otras enzimas de la miel ...................................... 15 1.3 Procesado de la miel .................................................................................................... 17 1.4 Cristalización de la miel y tratamientos térmicos ........................................................ 20 1.5 Calidad de la miel y la actividad enzimática como indicador....................................... 21 1.6 Adulteración ................................................................................................................. 22 1.7 Cooperativa Apícola Villa de Soto ................................................................................ 24
2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
25
2.1 Hipótesis ....................................................................................................................... 25 2.2 Objetivos....................................................................................................................... 25
3 MATERIALES Y MÉTODOS
26
3.1 Reactivos y equipos ...................................................................................................... 26 3.2 Muestras de mieles ...................................................................................................... 27 3.3 Determinación de actividad de α-glucosidasa ............................................................. 28 3.4 Determinación de la fluorescencia intrínseca de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................... 33 3.5 Determinación de actividad enzimática y parámetros cinéticos de α-glucosidasa en miel ..................................................................................................................................... 35 3.6 Tratamiento térmico de mieles simulados en laboratorio .......................................... 36 3.7 Adulteración de miel con jarabe mezcla y determinación de actividad α-glucosidasa37 3.8 Determinación de proteína en miel ............................................................................. 38 3.9 Determinación de parámetros físico-químicos en mieles ........................................... 39
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3.10Análisis estadístico de resultados y gráficos ................................................................ 40
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
40
4.1 Características físico-químicas de las mieles estudiadas ............................................. 40 4.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estructura de la enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae .................................................................. 42 4.3 Efecto de la temperatura y tratamientos térmicos simulados en laboratorio sobre la actividad α-glucosidasa en miel .......................................................................................... 56 4.4 Efecto de la adulteración de miel con jarabe mezcla en la actividad α-glucosidasa ... 68
5 CONCLUSIONES
73
6 PROYECCIONES FUTURAS
74
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
APÉNDICES
80
Apéndice 1: Diagrama de flujo de procesamiento y fraccionamiento de miel ................... 80 Apéndice 2: Pasterurizador M3 marca Farli ........................................................................ 81 Apéndice 3: Tabla comparativa de requisitos mínimos establecidos para miles según el CAA, la Resolución GMC N° 015/94, CODEX STAN 12:1981 e IHC ............................................... 82 Apéndice 4: Efecto en la actividad enzimática de los tratamientos térmicos aplicados en cada miel (M1, M2, M3 y M4) ............................................................................................. 83 Apéndice 5: Efecto de la adulteración con jarabe mezcla en la actividad α-glucosidasa en cada miel (M1, M2, M3 y M4) ............................................................................................. 90 Apéndice 6: Certificado de análisis del Jarabe Mezcla marca Sucrodex, de QUIMINSA..... 95 Apéndice 7: Presentación del trabajo en el VII Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Córdoba, Argentina .............................................................. 96
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INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Procedencia e identificación de las mieles utilizadas.
28
Tabla 2: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de tiempo de enzima α-
glucosidasa purificada a partir de Saccharomices cerevisiae.
32
Tabla 3: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de enzima α-glucosidasa purificada
a partir de Saccharomyces cerevisiae.
32
Tabla 4: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de cinética de α-glucosidasa
purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae.
33
Tabla 5: Esquema del diseño de experimento para la determinación del efecto de la temperatura en la emisión de fluorescencia de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae.
34
Tabla 6: Detalle de la construcción de cada muestra para la determinación de la actividad de la -
glucosidasa de la miel.
35
Tabla 7: Construcción de cada muestra para la determinación de la curva de actividad enzimática
en la miel M1.
36
Tabla 8: Construcción del experimento de los 10 tratamientos térmicos usados en mieles.
36
Tabla 9: Construcción de las muestras para la determinación de adulteración.
38
Tabla 10: Caracterización físico química de las mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba). 41
Tabla 11: Vmax y Km obtenidos experimentalmente para temperaturas de incubación 30, 40, 50 y
60°C para la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae.
50
Tabla 12: Porcentaje de intensidad de fluorescencia (IF) respecto a la IF a 25 °C de solución de α-
glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de calentamiento y
enfriamiento.
54
Tabla 13: Resultados obtenidos de NI para las cuatro mieles del Departamento de Cruz del Eje y
valores obtenidos por el Laboratorio INTI-Agroalimentos.
60
Tabla 14: Porcentaje de disminución de la actividad enzimática en mieles después de recibir
tratamientos térmicos simulados en laboratorio.
63
Tabla 15: NI de las muestras control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de las
muestras con tratamientos térmicos para las cuatro mieles.
66
Tabla 16: Concentración de glucosa en mieles y jarabe mezcla, y las concentraciones finales de las
mezclas realizadas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe.
69
Tabla 17: Concentración de fructosa en mieles y jarabe mezcla, y las concentraciones finales de
las mezclas realizadas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe.
69
Tabla 18: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de
muestras con tratamientos térmicos para la miel M1.
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Tabla 19: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de
muestras con tratamientos térmicos para la miel M2.
86
Tabla 20: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de
muestras con tratamientos térmicos para la miel M3.
87
Tabla 21: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de
muestras con tratamientos térmicos para la miel M4.
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Estructura tridimensional de α-glucosidasa de Apis mellifera (variante III). 16
Figura 2: Hidrólisis de la sacarosa (α-D-glucopiranosil-β-D-fructofuranósido) con la enzima
α-glucosidasa.
17
Figura 3: Departamentos que conforman el Noroeste de Córdoba.
25
Figura 4: Mecanismo de transformación del pNPG por la acción de la α-glucosidasa. 28
Figura 5: Termopar digital y ubicación dentro de tubo de Khan con la muestra; y disposición
de los tubos en la gradilla.
37
Figura 6: Curva de calibración de pNP- en medio buffer-fosfato y Tris-HCl pH 9,0 a 24 °C.43
Figura 7: Curvas de tiempo para concentraciones de sustrato (pNPG) de 0,6 mM y 17 mM
a concentración constante de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae
enzima.
45
Figura 8: Relación entre la concentración de la enzima α-glucosidasa purificada a partir de
Saccharomyce cerevisiae y la A400nm como medida de velocidad de reacción.
46
Figura 9: Curva de sustrato para la actividad de α-glucosidasa purificada a partir de
Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de incubación de 30, 40, 50 y 60 °C.
47
Figura 10: Variación de la velocidad de formación de producto de α-glucosidasa purificada
a partir de Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de incubación de 30, 40, 50 y 60 °C a
distintas concentraciones de pNPG.
49
Figura 11: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática y la afinidad de la α-
glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae para la hidrólisis de pNPG. La
línea de puntos azul señala la temperatura óptima para la enzima.
50
Figura 12: Espectros de fluorescencia intrínseca de α-glucosidasa purificada a partir de
Saccharomyce cerevisiae durante el proceso de calentamiento.
52
Figura 13: Porcentaje de variación de la intensidad de fluorescencia (IF) respecto a la IF a 25 °C de solución de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae. 53
Figura 14: Efecto del ciclo de calentamiento-enfriamiento sobre los valores de máx de
espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de α-glucosidasa de Saccharomyce
cerevisiae
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Figura 15: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la α-glucosidasa en la
miel M1.
56
Figura 16: Curva de sustrato para la actividad de α-glucosidasa de la miel a 40 °C para la
miel M1.
59
Figura 17: Gráfico de NI para el control y muestras con tratamientos térmicos (combinación
de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio a 60 °C y tiempos de exposición de 5,
10, 15 y 20 min con calentamiento previo de 50 °C por 30 min. Para cada grupo, las medias
con una letra común no son significativamente diferentes para p≤0,05 (Análisis de varianza
con test a posteriori LSD de Fisher). La línea de puntos azul señala el valor mínimo
recomendado internacionalmente de NI.
61
Figura 18: Gráfico de NI para el control y muestras con tratamientos térmicos (combinación
de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio a 70 °C y tiempos de exposición de 1
min 30 s, 3, 5, 10, 15 y 20 min con calentamiento previo de 50 °C por 30 min. Para cada
grupo, las medias con una letra común no son significativamente diferentes para p≤0,05
(Análisis de varianza con test a posteriori LSD de Fisher). La línea de puntos azul señala el
valor mínimo recomendado internacionalmente de NI.
62
Figura 19: Gráfico de puntos de actividad α-glucosidasa expresada como actividad
específica según tratamientos a 60 °C y 70 °C a iguales tiempos (5, 10, 15 y 20 min) para las
mieles M1, M2, M3 y M4. Comparación de pares de datos para cada tiempo (5, 10, 15 y 20
min) y prueba de significancia a través del test de Student. Las medias con una letra común
no son significativamente diferentes (p≤0,05).
64
Figura 20: Gráfico de barra de NI para las muestras control y muestras con tratamiento
térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para las cuatro
mieles.
66
Figura 21: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de las mieles M3 y M4 a
distintas temperaturas de incubación (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y
jarabe mezcla de 10 % P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P.
Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que
mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P=
0,050).
71
Figura 22: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M1.
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Figura 23: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M2.
85
Figura 24: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M3.
87
Figura 25: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M4.
88
Figura 26: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M1 a distintas
temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 %
P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras
diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que
mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P=
0,050).
91
Figura 27: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M2 a distintas
temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 %
P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras
diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que
mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P=
0,050).
92
Figura 28: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M3 a distintas
temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 %
P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras
diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que
mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P=
0,050).
93
Figura 29: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M4 a
distintastemperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de
10 % P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P y muestra control.
Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que
mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P=
0,050).
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ABREVIATURAS
ANMAT AOAC Asp CAA CXS FAO FTIR FTIR-ATR
Glu GMC HMF HPAEC-PAD
HPLC HPLC-IRMS
IF IHC INTI IUBMB JMAF MERCOSUR NI NIR OMS P/P pNP pNPpNPG β-PNPG RENAPA SAGPyA SCIRA SENASA TLC Tris
Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica Association of Official Analytical Chemists Ácido aspártico Código Alimentario Argentino Codex Alimentarius Standard Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier con reflectancia total atenuada Ácido glutámico Grupo Mercado Común Hidroximetilfurfural Cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada Cromatografía líquida de alto rendimiento Cromatografía líquida de alto rendimiento con espectrómetro de masas de relación isotópica Fluorescencia intrínseca International Honey Commission Instituto Nacional de Tecnología Industrial International Union of Biochemistry and Molecular Biology Jarabe de maiz de alta fructosa Mercado Común del Sur Número de invertasa Espectroscopía de infrarrojo cercano Organización Mundial de la Salud Peso en peso 4-nitrofenol 4-nitrofenolato 4-nitrofenil-α-D-glucopiranósido (también α-PNPG) 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido Registro Nacional de Producciones Apícolas Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación Espectroscopía de masa de carbono Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Cromatografía de capa fina tris (hidroximetil) aminometano
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
RESUMEN
La miel es un producto natural complejo constituido principalmente por hidratos de carbono, agua y otros constituyentes en menor proporción como ácidos orgánicos, proteínas, aminoácidos, enzimas, sustancias aromáticas, minerales, pigmentos, etc. Su calidad disminuye con el sobrecalentamiento, el envejecimiento y la adulteración. En ese sentido, las reglamentaciones de cada país y Codex Alimentarius exigen ciertos parámetros de calidad utilizando indicadores como el contenido de 5-hidrometilfurfural y la actividad diastasa. Sin embargo, la actividad α-glucosidasa (también llamada invertasa) es más sensible al calor que la actividad diastasa considerándose un mejor indicador. La adulteración, consiste en el agregado de azúcares y jarabes industriales para obtener mieles más fluidas que resultan atractivas para el consumidor, son más económicas y facilitan los procesos industriales. En este trabajo proponemos determinar algunos parámetros fisicoquímicos de mieles del Departamento de Cruz del Eje y estudiar el efecto de tratamientos térmicos simulados en laboratorio sobre la actividad de la enzima αglucosidasa presente en la miel para brindar sugerencias de tiempo y temperatura en los procesos térmicos a los cuales es sometida. Además, dado que los adulterantes podrían interferir la hidrólisis del sustrato artificial de la α-glucosidasa (4-nitrofenil-α-Dglucopiranósido), se propone estudiar este efecto para identificar una posible adulteración. A modo de referencia y para poner a punto el método, se estudió el efecto de la temperatura sobre la actividad y también sobre la estructura de la enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae.
Para este trabajo se estudiaron cuatro mieles genuinas de productores del Dpto. de Cruz del Eje (Córdoba). Los tratamientos térmicos, simulados en laboratorio, consistieron en el calentamiento a temperaturas equivalentes a las utilizadas en las salas de extracción de miel para la “pasteurización” (60 °C y 70 °C) y distintos tiempos con precalentamiento. La adulteración intencional se realizó con jarabe mezcla de uso alimentario comercial al 10% P/P y 20 % P/P. La actividad α-glucosidasa fue determinada por el método modificado Siegenthaler recomendado por la International Honey Commission. Los resultados fueron expresados como Número de Invertasa (NI), M/min, µmoles/min o como actividad específica según el caso. Los parámetros cinéticos Km y Vmax se determinaron utilizando el modelo de Michaelis-Menten en el rango de 30 °C a 60 °C.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
La temperatura óptima para la actividad de la enzima purificada de Saccharomyces cerevisiae fue 40 °C (Km=0,22 mM ± 0,02, Vmax=1,81 ± 0,04 µmol/min/mg de proteína). Por encima de esta temperatura la actividad disminuyó, lo que fue coherente con la pérdida irreversible de estructura de la proteína evidenciada por la disminución de su intensidad de fluorescencia intrínseca (IF) a temperaturas superiores a los 40 °C. Un comportamiento similar se observó para la enzima presente en las mieles.
Todas las mieles tratadas térmicamente experimentaron una disminución del NI respecto al control. Los tratamientos que llevaron a una disminucion del NI por debajo de 10, minimo recomendado internacionalmente, fueron aquellos a 60 °C por más de 15 min y a 70 °C por más de 10 min. El promedio de la reducción de la actividad α-glucosidasa fue del 33 % para las mieles que recibieron un tratamiento a 60 °C por 20 min y de 37 % para las mieles que recibieron un tratamientos a 70 °C por 15 min y 20 min, con un precalentamiento a 50 °C por 30 min y enfriamiento posterior en todos los casos.
La actividad α-glucosidasa permitió distinguir la adulteración de la miel a partir del 20 % P/P de jarabe.
Este trabajo permitió adaptar el método recomendado por la IHC para la determinación de α-glucosidasa a volúmenes pequeños compatibles con el uso de espectrofotómetros, particularmente en lectores de placa permitiendo economizar reactivos y tiempo de medición.
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1. INTRODUCCIÓN
1.1 La miel La miel es un producto natural elaborado por las abejas melíferas (Apis mellífera) a
partir del néctar de las flores o mielada. Es considerada un producto alimenticio el cual ha sido consumido desde épocas remotas por el hombre. Aunque se le conocen otros usos (en medicina, cosmética, como preservador de alimentos, etc.) (Bogdanov S., et al., 2009), se puede afirmar que su principal uso es como alimento y/o edulcorante tanto para consumo directo o uso industrial como ingrediente en preparaciones alimenticias.
Por tratarse de un alimento, el Codex Alimentarius, organismo que depende de la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) y la OMS (Organización Mundial de la Salud), ha establecido los parámetros de calidad/inocuidad de la miel y sus límites aceptables. La norma aplicable, con sus correspondientes modificaciones, es la CXS 12-1981. En nuestro país, el Código Alimentario Argentino (CAA) es el que fija la norma a aplicar en el territorio argentino. Los parámetros para cumplir se encuentran descriptos en el Capítulo X del Código a partir del artículo 782. La aplicación en el MERCOSUR (Mercado Común del Sur) está establecida en la Resolución GMC N° 015/94.
El CAA define por miel “el producto alimenticio producido por las abejas melíferas a partir del néctar de las flores o de las secreciones procedentes de partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de plantas, que las abejas recogen, transforman, combinan con sustancias específicas propias y almacenan y dejan madurar en los panales de la colmena” (CAA, 1995). En Argentina es considerada un producto de origen animal, y si bien el CAA dentro de la órbita del ANMAT (Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica) da las disposiciones higiénico-sanitarias, bromatológica y de identificación comercial del producto; el control para su elaboración y comercialización está a cargo del SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria) (SAGPyA-SENASA, 2006).
Químicamente, la miel es una solución concentrada de azúcares. En promedio los carbohidratos de la miel no superan el 82,3 %. Alrededor del 90% del total de azúcares en la miel están conformados por dos azúcares simples: glucosa y fructosa en porcentajes aproximados de 40 % y 30 % respectivamente, dependiendo esto del origen botánico. Estos productos provienen de la descomposición de la sacarosa la cual también se encuentra
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presente la miel, pero en muy baja proporción (Baglio, 2018). Contiene, además, una mezcla compleja de otros hidratos de carbono, enzimas, aminoácidos, ácidos orgánicos, minerales, sustancias aromáticas, pigmentos, cera y granos de polen. Las proteínas presentes en la miel provienen fundamentalmente del polen. El color varía de casi incoloro a pardo oscuro. Su consistencia puede ser fluida, viscosa, o total o parcialmente cristalizada.
La miel es operculada por la abeja en el panal conteniendo normalmente entre 17 % y 18 % de agua, superando este valor sufre problemas de fermentación por falta de madurez de la miel (Baglio, 2018). Según la legislación argentina, el contenido de agua no puede superar el 18 % y no debe contener ningún tipo de aditivos ni conservantes para ser comercializada (CAA, 1995).
Las características de la miel dependen de los néctares que le dieron origen, de las condiciones del suelo y el ambiente donde crecieron las plantas que aportaron esos néctares, de la época de la cosecha y genética de la abeja reina. La caracterización de una miel se define a través de análisis fisicoquímicos, polínicos y sensoriales. (Gaggiotti, M., et al., 2009; Costa, et al., 2016).
En resumen, la miel es la transformación del néctar (solución conformada por un 60% de agua, sacarosa, glucosa, fructosa, aminoácidos y minerales) recolectado por las abejas, llevado a la colmena donde sufre un proceso de transformación, básicamente reducción del contenido de agua y la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa gracias a la acción de la enzima invertasa segregada por las glándulas hipofaríngeas de las abejas obreras. Este proceso continúa después de la extracción y depende del tiempo y tipo de almacenamiento (White J. W., 1979). 1.2 Enzima α-glucosidasa (invertasa) y otras enzimas de la miel
La principal enzima de la miel, que proviene de las abejas melíferas y es responsable de la descomposición de la sacarosa del néctar en azúcares invertidos como glucosa y fructosa, fue denominada inicialmente como invertasa (White J. W., 1979). Esta enzima es una α-glucosidasa (EC 3.2.1.20 según la nomenclatura de la IUBMB o también α-Dglucoside glucohidrolasa). En el cuerpo de las abejas, se ha identificado la presencia de varios tipos de invertasas (tipo I, II y III). De ellas, la variante tipo III, presente en las glándulas hipofaríngeas de la Apis mellifera, es la que es agregada al néctar para su
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
conversión en miel durante la maduración en la colmena (Kubota M., et al., 2004). La glucosidasa de Apis mellifera (variante III) presenta una estructura de Barril (/)8 de 567 aminoácidos, siendo su peso molecular 65.565. En la Figura 1 se muestra un modelo por homología basado en la sacarosa hidrolasa de "Bombyx mori GH13".
Figura 1: Estructura tridimensional de α-glucosidasa de Apis mellifera (variante III). Modelo por homología basado en la sacarosa hidrolasa de "Bombyx mori GH13" H9J974, 6lga.1.A,
SMTL Version 2021-08-11; Seq Identity 44,92%. Average Model Confidence (QMEANDisCo): ± 0,05. (https://swissmodel.expasy.org/repository/uniprot/Q17058?csm=A14D88DD657C99C2).
El hecho de que instituciones como la International Honey Commission, creada en 1990 para generar una norma internacional de miel, en su compilado “Harmonised methods of the International Honey Commission” utilice la denominación actividad invertasa para referirse a la actividad de la α-glucosidasa (Pontoh, 2001; Huber R. E & Mathison R. D., 1976) y que la IUBMB ha reservado el nombre de “invertasa” para la βfructofuranosidasa (EC 3.2.1.26), ha generado confusiones en algunos trabajos de investigación de enzimas en miel.
La α-glucosidasa de la miel es una glucosil hidrolasa que hidroliza los enlaces glucosídicos, α-1,4 del extremo no reductor de un sustrato, generando como producto α-D-glucosa. Es decir que es una exoamilasa que actúa mediante un mecanismo que conserva el estado anomérico de la molécula. Estas enzimas a menudo poseen la capacidad de transglicosilación (Huber R. E & Mathison R. D., 1976).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Figura 2: Hidrólisis de la sacarosa (α-D-glucopiranosil-β-D-fructofuranósido) con la enzima αglucosidasa.
En la miel también existe la β-glucosidasa, descubierta en ensayos de rutina de la αglucosidasa pero en vez de usar como sustrato α-PNPG se sustituyó por el β-PNPG, sin embargo esta enzima no interviene en el desdoblamiento de la sacarosa por contener αglucosa ligada (Low N., et al., 1986). También se encuentran otras enzimas, como la diastasa, que descompone los almidones en glucosa. Esta última es la más conocida ya que se dispone de métodos sencillos para medir su actividad y como es inestable frente al calor reporta información sobre la calidad de la miel (White J. W., 1979). 1.3 Procesado de la miel
Argentina es el tercer productor de miel a nivel mundial después de China y Estados Unidos. Entre el 90 % y el 95 % de la producción se exporta a granel. Según datos del RENAPA (Registro Nacional de Productores Apícolas) de 2019 existen más de 11000 productores registrados y casi 3 millones de colmenas (RENAPA, 2019). Córdoba es la cuarta provincia con mayor producción en el país, muy cerca de Santa Fe quién ocupa el tercer lugar. El 95 % de la producción es realizada por pequeños productores apícolas (Ministerio de Agricultura Ganadería y Pesca, 2019).
La miel es comercializada a granel o fraccionada, por lo cual sufre un proceso de extracción de la colmena. Este proceso tiene diversas etapas según la cantidad de miel a procesar y calidad deseada. La miel puede contener polen, cera de abeja y otros materiales indeseados como levaduras, los cuales son removidos para mejorar la calidad y la inocuidad.
Existen dos procesos de práctica habitual en establecimientos productivos que son el filtrado y el calentamiento. El filtrado separa los materiales no deseados y los procesos térmicos eliminan microorganismos responsables del deterioro, reducen la humedad (Subramanian R., et al., 2007) y retrasan el proceso natural de cristalización (Baglio, 2018).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Las mieles utilizadas para este estudio corresponden a mieles del monte nativo del Noroeste de Córdoba y la época de cosecha en esta zona se realiza de octubre a diciembre. La cosecha de miel se lleva a cabo a temperatura ambiente superando los 30 °C y pudiendo llegar a los 40 °C dependiendo de la zona y los horarios de operación.
A continuación, se describen los procesos básicos utilizados en salas de extracción en procesos productivos a pequeña escala. Recepción, descarga y almacenamiento de alzas
Las alzas (estructura en cuyo interior se colocan los cuadros que contienen los panales de cera estampada donde la abeja elabora y almacena la miel) son recibidas en la sala de extracción. Éstas pueden ser almacenadas por unos días manteniendo la aireación y prevención de plagas, aunque lo más habitual es su procesamiento inmediatamente al llegar. Desoperculado
El desoperculado consiste en retirar el opérculo de cera que cubre la miel madura en el panal. Esto se realiza generalmente con un equipo tipo guillotina o bien a mano con cuchillo desoperculador. Estos equipos generan calor durante el proceso, entre 35 y 38 °C, teniendo un control de la temperatura según el equipo utilizado, o casi sin control o nulo, usando el cuchillo desoperculador. Mediante este proceso por un lado se obtiene cera, miel y algunas impurezas y por otro, el panal con miel que va al siguiente proceso. Extracción
La extracción se realiza generalmente, colocando el panal en un equipo que mediante la fuerza centrífuga y gravedad extraerá la miel. También puede realizarse por proceso de prensado de los panales o bien por escurrido. Tamizado y depósito de miel
El tamizado de la miel se realiza para eliminar la mayor cantidad de impurezas tales como restos de cera, abejas y otras impurezas de gran tamaño. En general se utilizan tamices de paso menor a 5 mm (Marini, s.f.) pudiendo utilizar temperatura para facilitar el proceso, pero sin superar los 40 °C (Subramanian R., et al., 2007). La miel extraída se almacena temporalmente en depósitos.
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Decantado de miel La miel es elevada mediante bombas adecuadas a tanques de decantación. Este
proceso se realiza en forma natural dejando en reposo la miel por 48 horas (Marini, s.f.). Las partículas pesadas se acumulan en el fondo del tanque (decantación) y las livianas quedan en la superficie (espumado) las cuales son removidas con utensilios especiales. El decantado se considera un proceso de purificación. Pasteurización
El proceso de pasteurización es un proceso térmico que combina temperatura y tiempo. El objetivo de este proceso es reducir el contenido de hongos y levaduras, pero también permite reducir la viscosidad de la miel para facilitar los procesos de transporte, filtrado, envasado y retardar los procesos de cristalización en góndola. Este proceso generalmente se aplica a mieles que se fraccionan para la venta. Existen en el mercado diversos equipos desde equipos convencionales (calentador eléctrico para tambores) a equipos automáticos de ultra alta temperatura donde la miel es sometida a unos 78 °C por 2 minutos. Filtrado
La miel puede tener un proceso de filtrado antes del envasado, cuando la miel está a temperaturas que no superan los 40 °C, para así obtener una miel cristalina. En otros casos la filtración se realiza durante la pasteurización aprovechando la mayor fluidez de la miel a causa de las temperaturas más elevadas. Esta filtración por presión se realiza a través de mallas de 80 a 100 µm (Subramanian R., et al., 2007). En algunos países de Europa se exige que la malla filtrante no sea menor a 200 µm de tal modo de evitar retener el polen (Bogdanov, E. & Martin, P., 2002), teniendo en cuenta que el polen tiene un diámetro que varía entre 10 y 60 µm de acuerdo a la especie floral habiendo de mayor tamaño (White J. W., 1979) y es un indicador del origen botánico de la miel que se desea preservar. Envasado en tambores
Las mieles comercializadas a granel son envasadas en tambores y destinas para diversos usos. En esta etapa se admiten mezclas de mieles, en tal caso se utilizan tanques mezcladores/homogeneizadores con regulación de temperatura para lograr la mezcla deseada.
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En Argentina, la miel debe ser envasada en tambores de 300 kg de primer uso según Resolución SENASA 121-98 autorizados por SENASA (SENSASA, 1998), y debe rotularse según la Resolución SENASA 186-03 (SENASA, 2003) para asegurar la trazabilidad del producto. Fraccionado
El fraccionado puede realizarse a mano o en equipos automáticos en envases bromatológicamente aptos. Las empresas fraccionadoras deberán cumplir con lo establecido en el CAA. En el Apéndice 1 se muestra un Diagrama de Flujo del proceso de fraccionamiento de la miel. 1.4 Cristalización de la miel y tratamientos térmicos
Como se dijo anteriormente, la miel es una solución concentrada de azúcares. Esta solución está sobresaturada con una concentración de más del 70 % de azúcares con relación al agua que normalmente es menos del 20 % y por lo tanto tiende a cristalizar separándose la glucosa que es la responsable de este fenómeno en la miel (Valega, 2005). El proceso de cristalización involucra la formación de cristales de glucosa monohidradada en diferentes cantidades, formas, y disposición dependiendo de las condiciones del proceso. Este es un proceso que se lleva a cabo naturalmente en todas las mieles, y la tendencia y rapidez en cristalizar depende de varios factores. Las mieles con menos concentración de agua y alta concentración de glucosa tienen mayor tendencia a cristalizar como así también las almacenadas a temperaturas por debajo de los 14 °C (Baglio, 2018). Ciertos factores son necesarios para que comience la cristalización: la presencia de núcleos adecuados de condensación o simples cristales de glucosa, partículas extrañas, pequeños granos de polen o microburbujas de aire (Baglio, 2018).
El procesado de la miel involucra, en muchos casos, procesos térmicos. Estos procesos se aplican para: reducir la viscosidad de la miel y así facilitar el filtrado, bombeo, transporte y envasado; reducir el contenido de agua para prevenir la fermentación; disolver los núcleos de cristales de glucosa para retardar la cristalización; homogenizar el color según preferencias del consumidor y destruir las levaduras osmofílicas tolerantes al azúcar para prolongar la vida útil de la miel. El calentamiento es el proceso de mayor importancia en el procesado de la miel porque afecta directamente la calidad (Chua, et al., 2014).
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La cristalización natural de la miel presenta el inconveniente que no es aceptada por el consumidor promedio en muchos países, que interpreta, equivocadamente, que la miel ha si sido adulterada con el agregado de azúcar refinada y rehúsa adquirirla (Valega, 2005). Es entonces, una práctica habitual el calentamiento de la miel principalmente para obtener mieles líquidas por más tiempos que son del gusto del consumidor. En general, las mieles que se exportan son sometidas a procesos térmicos y almacenados durante períodos más largos antes de llegar al mercado. El proceso térmico ayuda a la preservación del producto por más tiempo (Bogdanov, E. & Martin, P., 2002). Está demostrado que el calor es el único agente práctico para prevenir la granulación y fermentación, pero es la causa del deterioro de la calidad de la miel (White J. W., 1979), como se verá más adelante.
El almacenamiento se debe entender también como parte del proceso productivo, teniendo en cuenta que la miel ya no es un producto de consumo estacional, sino que es requerida durante todo el año. La miel fuera de la colmena continúa con el proceso de maduración ya que las enzimas siguen activas (Lichtenberg-Kraag, 2012). También hay que tener en cuenta que la miel es un producto altamente higroscópico, por lo que una mala conservación deriva en aumento de la humedad favoreciendo la fermentación. Los cambios que ocurren en la miel durante el calentamiento en el proceso de extracción también ocurren durante el almacenamiento dependiendo de las temperaturas de conservación. Las temperaturas de almacenamiento que favorecen la cristalización se encuentran ente 10 °C a 16 °C, y las que favorecen el deterioro son aquellas que superan los 27 °C (White J. W., 1979). 1.5 Calidad de la miel y la actividad enzimática como indicador
Dado que la miel es considerada un alimento, los requisitos de calidad/inocuidad son fijados internacionalmente por Codex Alimentarius en la reglamentación CXS 12-1981 y enmendada en el 2019. En Argentina, basándose en los requisitos del Codex, rige la Resolución GMC N° 015/94 incorporada en el Código Alimentario Argentina en 1995. Esta reglamentación es aplicable a todos los países que conforman el MERCOSUR. En el Apéndice 3 se muestra una tabla comparativa con los requisitos de estas reglamentaciones.
Para poder determinar la calidad e inocuidad de miel es necesario la realización de diversos análisis o determinaciones según el objetivo de calidad perseguido. Estos son (INTI, 2009):
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• Calidad sanitaria: ensayos microbiológicos, plaguicidas, metales y antibióticos. • Madurez y conservación: humedad refractométrica. • Deterioro del producto: acidez (fermentación), Hidroximetilfurfural (HMF) y
actividad diastásica (frescura e indicador de proceso). • Limpieza del producto: sólidos insolubles en agua. • Adulteración del producto: glucosa comercial y jarabe de maíz de alta fructosa
agregados (aditivos). • Adulteración y madurez: azúcares reductores y sacarosa aparente. • Lealtad comercial: peso neto, evaluación de la información al consumidor y origen
botánico (sólo para las marcas que lo identifiquen o declaren). • Características organolépticas: sabor y olor característicos de la miel.
El contenido de HMF y actividad diastásica son los dos parámetros usados internacionalmente para controlar los límites de los tratamientos térmicos de la miel (Chua, et al., 2014). El HMF es un producto de descomposición del azúcar, que surge especialmente cuando se sobrecalienta y se almacena incorrectamente la miel, por otro lado, se puede observar un debilitamiento en la actividad diastásica por el efecto del calor (White J. W., 1979). Ambos son indicadores de “frescura” de la miel. Mientras el valor de HMF aumenta, el valor de actividad enzimática disminuye. Si bien en general se determina la actividad diastásica para evaluar la actividad enzimática, la actividad de la enzima αglucosidasa (llamada actividad invertasa) es más sensible al calor que las amilasas y bajan su actividad más rápido durante el almacenamiento comparado con las amilasas (Vorlová L. & Pridal A., 2002). Por tal motivo, la actividad de esta enzima es una alternativa para la evaluación de la calidad de la miel durante los tratamientos térmicos y almacenamientos o como indicador de frescura. En algunos países como Italia y Suiza, ya se está utilizando la actividad α-glucosidasa como un criterio adicional de calidad de miel (Dimins, et al., 2006), y la Asociación Alemana de Apicultores han fijado valores específicos de HMF y actividad invertasa para distinguir mieles genuinas de aquellas tratadas térmicamente o mal almacenadas (Deutscher Imkerbund E.V., consultado en febrero del 2020). 1.6 Adulteración
La miel genuina es un producto natural relativamente costoso, y es por lo que a lo largo de los años ha sufrido procesos de adulteración intencional debido a los altos costos
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de producción, poco margen de ganancias, la existencia de adulterantes disponibles a bajo costo y la desactualización de las metodologías oficiales para la detección de fraude (García, 2016). La adulteración se da tanto en los mercados nacionales como en los internacionales. Algunos exportadores inescrupulosos, adulteran grandes cantidades de miel con jarabes para obtener un precio competitivo a nivel internacional (dumping comercial). Esto último es bien descripto en el trabajo de García donde compara los principales países exportadores de miel y el crecimiento exagerado de las exportaciones de los países asiáticos (García, 2016). La adulteración es una cuestión de lealtad comercial y protección al consumidor. Según Bogdanov y Martin la autenticidad de la miel tiene dos aspectos diferenciados: respecto a la producción de miel y respecto a la descripción geográfica y botánica de origen (2002). Esto último, si bien es importante, no es de interés para este trabajo.
Respecto a la producción de la miel, uno de los aspectos a tener en cuenta son las malas prácticas apícolas en alimentación artificial que pueden llevar a una adulteración no intencional. Esta alimentación es realizada con sacarosa o jarabe de maíz y se debería realizar exclusivamente cuando las colmenas se encuentren en cámara de cría y época alejada de la mielada, de lo contrario podrán aparecer restos de estos productos en las alzas melarias siendo considerado una adulteración (García Girou, 2003; Fattori, et al, s.f.).
La principal adulteración intencional de la miel se debe a la adición de azúcares invertidos o jarabes (jarabe de glucosa y jarabe de maíz de alta fructosa) por ser estos productos de menor valor comercial y de fácil acceso. Se considera adulteración porque la reglamentación aplicable a la miel (Codex Alimentarious y CAA) prohíbe el agregado de aditivos de cualquier tipo. Esta adulteración puede no ser fácilmente detectable mediante el análisis directo del azúcar porque sus componentes son los principales componentes naturales de la miel y por lo tanto el producto adulterado tendría propiedades físicas similares a la miel natural (Mehryar & Esmaiili, 2011).
Estos aditivos pueden ser detectados en la miel por contener dextrinas (azúcares superiores) provenientes del proceso de fabricación de estos jarabes siendo inexistentes en las mieles naturales (INTI, 2009). Existen diversos métodos de análisis capaces de detectar estos azúcares y cuantificarlos (cromatografía gaseosa y cromatografía líquida, espectroscopia NIR, FTIR-ATR, HPAEC-PAD, HPLC-IRMS, método calorimétrico (DSC), SCIRA,
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espectroscopía Raman con transformada de Fourier) (Mehryar & Esmaiili, 2011). Recientemente se ha incorporado la Resonancia Magnética Nuclear como el método más novedoso para la detección de adulteración de miel como así también para la determinación de su origen botánico, desarrollándose actualmente la base de datos que hará de ésta una herramienta de gran utilidad (García, 2016). Sin embargo, todos estos métodos requieren de equipamientos costosos y personal especialmente formado. 1.7 Cooperativa Apícola Villa de Soto
Este trabajo se realizó con mieles provenientes de la Cooperativa Apícola de Villa de Soto Limitada, la cual funciona como tal desde el año 2011. Posee habilitación municipal y del SENASA. Según entrevista al Ing. Agr. Oscar Demarchi, miembro y tesorero de la Cooperativa, al momento del estudio la Cooperativa estaba conformada por 17 productores que poseían entre 100 y 700 colmenas, con una producción de aproximadamente 100.000 kg de miel en la campaña 2017-2018 (fines de octubre hasta comienzos de marzo).
La Cooperativa cuenta con las instalaciones y equipamiento necesarios para la producción de miel a granel, habiendo adquirido en el año 2017, a través de fondos del Ministerio de Trabajo y Empleo de la Nación, un equipo Pasteurizador Modelo M3 y una Envasadora automática con dosificador Modelo EV 304, ambos de la marca Farli. Estos equipos aún no estaban instalados ni en funcionamiento al momento del estudio. Con estos equipos se prevé la producción fraccionada para el mercado interno con el objetivo de dar valor agregado a la miel. La utilización de un Pasteurizador implicará someter a la miel a un proceso térmico. Según información brindada por el fabricante del Pasteurizador, el equipo realiza el proceso alcanzando temperaturas de entre 68-72 °C y 1 min 30 s de exposición pudiendo durar todo el proceso (entrada-salida) 7 min. En el Apéndice 2 se muestra el equipo pasteurizador.
Las mieles procesadas por la Cooperativa corresponden a apiarios del Noroeste de Córdoba, rodeados de flora nativa, por lo que las principales fuentes de polen y néctar son de especies características de la región fitogeográfica chaqueña (Costa, et al., 2016). En la Figura 3, se muestran los Departamentos comprendidos en el Noroeste de Córdoba.
Para este trabajo se obtuvieron muestras de 4 productores de la Cooperativa correspondiente a los meses de noviembre y diciembre de 2017, época de mayor
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producción apícola, del Departamento de Cruz del Eje. Las mieles no fueron sometidas a ningún proceso térmico ni almacenamiento previo al estudio.
Figura 3: Departamentos que conforman el Noroeste de Córdoba. Foto extraída del “Formulario de registro para indicación geográfica y denominación de origen”
presentado por la Mesa Apícola del Noroeste de Córdoba (2017).
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1 Hipótesis La actividad de la enzima invertasa (α-glucosidasa) presente en las mieles del
Departamento de Cruz del Eje (Córdoba), es sensible a cambios en su entorno tales como calentamiento o agregado de azucares o jarabes industriales, de manera tal que puede usarse como indicador de pérdida de calidad de la miel. 2.2 Objetivos Objetivo general
Determinar la actividad de la enzima α-glucosidasa presente en mieles de la Cooperativa Apícola Villa de Soto (Departamento de Cruz del Eje, Córdoba) y el efecto de diversos procesos térmicos asociados a su procesado, variando el tiempo y la temperatura, y de distintos grados de adulteración de las mieles genuinas, con azúcares invertidos.
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Objetivos específicos a) Determinar algunos parámetros fisicoquímicos que permitan corroborar la calidad y
frescura de las mieles, tales como pH, actividad de agua, conductividad, azúcares reductores, humedad, cenizas, minerales, actividad diastasa, actividad invertasa (αglucosidasa), y contenido HMF. b) Estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima α-glucosidasa relacionándolos con cambios de estructura de la enzima. c) Estudiar el efecto de distintos protocolos de pasteurización sobre la actividad de la enzima α-glucosidasa a fin de sugerir a la Cooperativa el más adecuado que permita preservar la calidad de sus mieles. d) Estudiar el efecto de la adulteración por agregado de azucares invertidos de las mismas mieles caracterizadas anteriormente, sobre la actividad de la enzima α-glucosidasa.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Reactivos y equipos 3.1.1 Reactivos
- Solución buffer-fosfato 0,1 M, pH 6,0 (Harmonised Methods IHC, 2009) - KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico) marca Merck. - Na2HPO4.2H2O (fosfato de sodio di básico di hidratado) marca Merck.
- Solución TRIS-HCl 3M, pH 9,5 (Harmonised Methods IHC, 2009) - Tris (hidroximetil) aminometano, marca Merck y Sigma regulación de pH con solución de HCl marca Cicarelli 3 M.
- Solución mezcla de buffer-fosfato 0,1 M, pH 6,0 y TRIS-HCl 3M, pH 9,5 en la siguiente proporción: 92 % de buffer fosfato y 8 % de Tris-HCl, pH final 9,0.
- pNPG (4-nitrofenil-α-D-glucopiranosa) ≥ 99%, N1377, marca Sigma-Aldrich. - pNP (4-nifrofenol) calidad analítica marca Anedra. - α-gucosidasa de Saccharomyces cerevisiae Tipo I. (EC 3.2.1.20) Polvo liofilizado G5003-
100UN, marca Sigma-Aldrich. - Jarabe mezcla grado alimenticio marcar Sucrodex de Quiminsa. - Bio-Rad Protein Assay - Albúmina sérica bovina. Fracción V, polvo liofilizado, marca Sigma.
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3.1.2 Equipos - Espectrofotómetro Multiskan Spectrum, modelo 51118650, marca Thermo Scientific. - Espectrofotómetro DU 7500, marca Beckman. - Flurómetro modelo Fluorolog 3-22 marca Horiba Scientific. - Cubeta de vidrio de 1 cm de espesor, cubeta de cuarzo de 1 cm de espesor y placa de cultivo de 96 wells. - Agitador vortex. - Baños termostatizados. - Termómetro de alcohol hasta 100 °C con resolución de 0,5 °C para control del baño termostático. - Termómetro digital con termopar tipo k marca Luft. - Cronómetro digital. - Micropipetas - 10 a 100 µl, marca Socorex - 100 a 1000 µl, marca Socorex - 2 a 20 µl, marca Eppendorf - 20 a 200 µl, marca Eppendorf - 100 a 1000 µl, marca Diagon - Balanza analítica OHAUS Analytical - Balanza analítica Mettler H35AR - Tubos de Khan de vidrio - Porta tubos de ensayo (gradillas) - Material de vidrio (matraces aforados, vasos de precipitados, varillas, etc.)
3.2 Muestras de mieles Se utilizaron cuatro mieles genuinas sin ningún tratamiento térmico, proporcionadas
por la Cooperativa Apícola Villa de Soto del Dpto. de Cruz del Eje, correspondientes a la campaña 2017. Las mieles fueron identificadas como M1, M2, M3 y M4 según se muestra en la Tabla 1. Las mismas fueron almacenadas en lugar oscuro, seco y fresco (temperatura de laboratorio), hasta la realización de los estudios. Las determinaciones fueron realizadas durante el 2018 y 2019.
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Tabla 1: Procedencia e identificación de las mieles utilizadas.
ID Fecha de cosecha
Procedencia
M1
9/11/2017 Costas de las Salinas
M2
12/11/2017 16 km al norte de Serrezuela
M3
3/12/2017 Las Cañadas
M4
5/12/2017 Bañado de Soto
3.3 Determinación de actividad de α-glucosidasa 3.3.1 Procedimiento general
El procedimiento general de trabajo utilizado es una modificación del método de referencia N° 9 del documento “HARMONISED METHODS OF THE INTERNATIONAL HONEY COMMISSION” publicado en 2009 por la IHC (Harmonised Methods of the International Honey Commission, 2009), basado en el método Siegenthaler (Siegenthaler, 1977).
El método Siegenthaler consiste en la hidrólisis del sustrato artificial pNPG (4nitrofenil-α-D-glucopiranosa) por la enzima α-glucosidasa, produciéndose por un lado α-Dglucopiranosa y por otro 4-nitrofenol. La reacción se detiene por el agregado de una solución fuertemente alcalina, lo que inhibe la reacción enzimática por el cambio de pH e induce la ionización total del 4-nitrofenol a 4-nitrofenolato, un compuesto coloreado que puede ser cuantificado midiendo la absorbancia a 400 nm con un espectrofotómetro. La cantidad de 4-nitrofenolato generado es equivalente a la cantidad de pNPG transformado. Este mecanismo se muestra en la Figura 4.
Figura 4: Mecanismo de transformación del pNPG por la acción de la α-glucosidasa.
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Confección de la muestra problema: En un tubo de Khan se agregó solución de sustrato y solución buffer-fosfato (0,1 M,
pH 6,0), se mezcló en vórtex y precalentó en baño termostatizado durante 5 min a la temperatura correspondiente según el experimento. Luego del precalentamiento se agregó la solución de prueba (que contiene la enzima), se mezcló en vórtex e incubó en baño termostatizado a la temperatura y el tiempo correspondientes según el experimento. Al finalizar el tiempo de incubación, el tubo se retiró del baño y se agregó inmediatamente solución de fin de reacción (Tris-HCl 3M, pH 9,5), se mezcló en vórtex y enfrió a temperatura ambiente (no más de 15 min) para posteriormente realizar la lectura a 400 nm en equipo Espectrofotómetro Thermo Scientific. Las lecturas fueron realizadas en cubeta de vidrio de paso óptico 1 cm (lectura individual) o bien se utilizó una placa de cultivo de 96 wells, incorporando un volumen de 200 µL en cada zócalo (lectura múltiple). Confección del blanco:
En un tubo de Khan se agregó: solución sustrato, solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0) y solución fin de reacción (Tris-HCl 3M, pH 9,5), se mezcló en vórtex y precalentó en baño termostatizado durante 5 min a la temperatura correspondiente según el experimento. Luego del precalentamiento se agregó la solución de prueba (que contiene la enzima), mezcló en vórtex e incubó en baño termostatizado a la temperatura y el tiempo correspondientes según el experimento. Al finalizar el tiempo de incubación se retiró el tubo y enfrió a temperatura ambiente (no más de 15 min) para posteriormente realizar la lectura a 400 nm en equipo Espectrofotómetro Thermo Scientific. Las lecturas fueron realizadas en cubeta o placa de cultivo, como se describió para la muestra problema.
Las determinaciones fueron realizadas como mínimo por duplicado y el blanco se preparó para cada solución de prueba.
Para el cálculo de absorbancia de la solución p-nitrofenolato se restó el valor absorbancia del tubo blanco al valor de absorbancia del tubo problema.
La actividad enzimática se expresó en µmol/min y la actividad específica en unidades internacionales, es decir µmol/min/mg de proteínas. También se calculó el NI (o unidades Gontarski) para expresar la actividad enzimática. El NI se refiere a la cantidad de sacarosa (g) hidrolizada en 1 hora por las enzimas contenidas en 100 g de miel bajo condiciones de prueba (Hadorn H., et al., 1962) y permite correlacionar los resultados obtenidos para la
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actividad de la invertasas por el método de Siegenthaler basado en la hidrólisis de pNPG con los que se obtienen por el método polarimétrico de Hadorn por medio de la siguiente relación NI = 21,64 x ApNP- 400nm, donde 21,64 es la pendiente de la regresión lineal del grafico NI (eje y) vs A400 (eje x) (Dustmann, et al., 1985).
En este trabajo, si bien hemos calculado también el NI para las mieles, los análisis se realizan sobre la actividad específica expresada en unidades internacionales. 3.3.2 Determinación de la longitud de onda (λ) de mayor absorción para el pNP- (4nitrofenolato)
Para esta determinación se preparó una solución concentrada de pNP 122,9 µM, pesando 1,71 mg y enrasando a 100 ml en matraz aforado, con una mezcla de bufferfosfato (0,1 M, pH 6,0) y Tris-HCl (3M, pH 9,5) en igual proporción que la mezcla resultante luego de detener la reacción enzimática en las pruebas de cinética (92 % de buffer-fosfato y 8 % de Tris-HCl). Esta solución tuvo un pH final de 9,0. Luego se realizó una dilución hasta una concentración de 20,5 µM para realizar las lecturas.
Se preparó un blanco con la mezcla de buffer-fosfato y Tris-HCl con la cual se trazó la línea de base y se registró el espectro de absorción entre 250 nm y 600 nm con un Espectrofotómetro Beckman DU 7500. 3.3.3 Determinación del coeficiente de extinción molar del pNP- (4-nitrofenolato)
Se construyeron las curvas de calibración con soluciones testigos a distintas concentraciones a partir de la solución madre de pNP (122,9 µM). Para el registro de la absorbancia se utilizó una cubeta de vidrio de paso óptico de 1 cm y una placa de cultivo de 96 wells con volumen de 200 µL y paso óptico de 0,505 cm calculado geométricamente. Las lecturas de absorbancia fueron realizadas en el Espectrofotómetro Thermo Scientific. Se graficaron los valores de absorbancia en función de la concentración M de pNP-. El coeficiente de extinción molar () se calculó, aplicando la Ley Lambert-Beer, como la pendiente de la recta de absorbancia dividida el paso óptico (Kolthoff, et al., 1979). 3.3.4 Determinación de parámetros cinéticos de α-glucosidasa por el modelo de Michaelis-Menten Se decidió utilizar la enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae EC 3.2.1.20 (maltasa) para poner a punto el método y adquirir la destreza necesaria para llevar adelante los ensayos de actividad enzimática. Se eligió esta enzima por la similitud
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
que presenta con la variante tipo III de -glucosidasa presente en las glándulas hipofaríngeas de la Apis mellifera y que finalmente formará parte de la miel. Según el sistema de clasificación CAZymes (Carbohydrate-Active enzymes database, http://www.cazy.org/), basado en similitudes en la secuencia de aminoácidos, en plegamiento de las proteínas y mecanismos enzimáticos (Henrissat, B., 1991; Henrissat & Bairoch, A., 1996; Lombard, et al., 2014), ambas, α-glucosidasas de la de Saccharomyces cerevisiae y la tipo III de Apis mellifera, se agrupan en la Familia 13, clan GH-H. Por su parte, Chiba las clasifica en la familia I en base a su estructura primaria ya que comparten 4 regiones altamente conservadas (I-IV). Además, ambas son capaces de hidrolizar pNPG y sus mecanismos catalíticos implican la participación de los aminoácidos Glu y Asp de la región 3 (Chiba, 1997). Curva de tiempo
Para esta determinación se midió la actividad enzimática, según el procedimiento descripto en el punto 3.3.1, a 6 tiempos distintos (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min), concentración constante de sustrato (17 mM y 0,6 mM) y temperatura de incubación de 40 °C.
Se preparó una solución de 0,2 mg/ml de enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae en solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0) y solución sustrato de pNPG de 0,02 M en solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0). A partir de los valores de absorbancia se calculó la actividad enzimática como cantidad de producto formado por minuto y se graficó en función del tiempo. En la Tabla 2 se muestra cómo fueron construidas las muestras para esta experiencia.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Tabla 2: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de tiempo de enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomices cerevisiae. Concentración constante de sustrato de 17 mM y 0,6 mM.
Reactivos
Tiempo (min)
(0,017 M de sustrato)
5
10
15
20
25
30
Sustrato 0,02 M (µl)
430
430
430
430
430
430
Enzima 0,2 mg/ml (µl)
12,5
12,5
12,5
12,5
12,5
12,5
Buffer-fosfato 0,1 M pH 6,0 (µl) 30,0
30,0
30,0
30,0
30,0
30,0
Tris 3M, pH 9,5 (µl)
42,5
42,5
42,5
42,5
42,5
42,5
Volumen total (µl)
515
515
515
515
515
515
Reactivos (0,0006 M de sustrato) Sustrato 0,02 M (µl) Enzima 0,2 mg/ml (µl) Buffer-fosfato 0,1 M pH 6 (µl) Tris 3M, pH 9,5 (µl) Volumen total (µl)
5 15 12,5 430,0 42,5 500
10 15 12,5 430,0 42,5 500
Tiempo (min)
15
20
15
15
12,5
12,5
430,0
430,0
42,5
42,5
500
500
25 15 12,5 430,0 42,5 500
30 15 12,5 430,0 42,5 500
Curva de enzima Para esta determinación se siguió el procedimiento descripto en el punto 3.3.1. Se
preparó una solución de 0,4 mg/mL (SE1) de enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae en solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0). A partir de esta solución se prepararon las demás diluciones (SE2, SE3, SE4 y SE5). Como sustrato se preparó una solución de pNPG de concentración de 0,02 M en solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0). En la Tabla 3 se muestra cómo fueron construidas las muestras para esta experiencia. Las muestras fueron incubadas a 40 °C por 20 min. Se graficaron los valores de absorbancia en función de concentración de enzima. Tabla 3: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae. Concentración constante de sustrato (17 mM).
Reactivos
Sustrato 0,02 M (µl) SE1 0,4 mg/ml (µl) SE2 4 µg/ml (µl) SE3 2 µg/ml (µl) SE4 6 µg/ml (µl) SE5 20 µg/ml (µl) Buffer-fosfato 0,1M, pH 6,0 (µl) Tris 3M, pH 9,5 (µl) Volumen total (µl)
0,05 830
25
60 85 1000
0,10 830 25
60 85 1000
Concentración de α-glucosidasa (µg/ml) 0,20 0,35 0,50 0,83 1,00 5,00 10,00 30,00 40,00 830 830 830 830 830 830 830 830 815
13 25 75 100
50
58 83
40 50
35 27
2
5
35 73 60 10
0
85 85 85 85 85 85 85 85 85
1000 1000 1000 960 1000 1000 1000 1000 1000
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Determinación de temperatura óptima y parámetros cinéticos Km y Vmax Para esta determinación se siguió el procedimiento descripto en el punto 3.3.1. Se
preparó una solución de 0,2 mg/ml de enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae y dos soluciones concentradas de sustrato pNPG, una de concentración 0,02 M y otra de 0,03 M. En ambos casos se utilizó como disolvente la solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0). En la Tabla 4 se muestra cómo fueron construidas las muestras para esta experiencia. Tabla 4: Detalle de la construcción de las muestras para curvas de cinética de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae. Concentración constante de enzima (5 µg/ml).
Reactivos
Sustrato 0,02 M (µl) Sustrato 0,03 M (µl) Enzima 0,2 mg/ml (µl) Buffer-fosfato 0,1M, pH 6,0 (µl) Tris 3M, pH 9,5 (µl) Volumen total (µl)
0,0002 0,0003 0,0006 10,0 15,0 30,0
25,0 880 85,0 1000
25,0 875 85,0 1000
25,0 860 85,0 1000
0,0009 45,0
25,0 845 85,0 1000
Concentración de pNPG (M) 0,0015 0,0030 0,0060 75,0 150 300
25,0 815 85,0 1000
25,0 740 85,0 1000
25,0 590 85,0 1000
0,0090
300 25,0 590 85,0 1000
0,0120
400 25,0 490 85,0 1000
0,0180
600 25,0 290 85,0 1000
0,0240
800 25,0 90 85,0 1000
Se determinó la actividad enzimática a distintas concentraciones de sustrato y distintas temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C); tiempo de incubación de 20 min.
A partir de los valores de absorbancia se calculó la actividad enzimática como cantidad de producto formado por minuto y por cantidad de proteína, y se graficó en función de la concentración de sustrato. Los valores de Vmax y Km fueron calculados en base al ajuste de los valores experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten (Fennema, O., 2010). 3.4 Determinación de la fluorescencia intrínseca de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae
Para poder observar como la temperatura afecta la estructura de la enzima, se utilizó la propiedad que tienen las proteínas de fluorescer producto de la re-emisión de fotones absorbidos; esto se debe a que las proteínas contienen aminoácidos aromáticos que son capaces de producir fluorescencia (Nilsen, 2003).
Para esta determinación se preparó una solución de 0,2 mg/ml de la enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae en solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0) y se diluyó a la mitad con solución buffer-fosfato para realizar las lecturas. La muestra fue sometida a un proceso de calentamiento y enfriamiento controlado en diversas
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condiciones de tiempo y temperatura utilizando un baño termostatizado conectado al fluorómetro marca Horiba Scientific.
El estudio se realizó considerando el proceso de precalentado a 50 °C por 30 min (tomado como referencia del proceso de licuado/homogeneizado de miel) y calentado a 60 °C por 10 min o 20 min (tomado como referencia del proceso de calentado/pasteurización de miel). En la Tabla 5 se muestra el diseño del experimento. Tabla 5: Esquema del diseño de experimento para la determinación del efecto de la temperatura en la emisión de fluorescencia de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae.
Calentamiento hasta 60 °C 10 min
Calentamiento
Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Calentar 30 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Calentar 10 min y tomar lectura
Temperatura de lectura °C 25 30 35 40 45 50 50 55 60 60
Calentamiento hasta 60 °C 20 min
Calentamiento
Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Calentar 30 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Calentar 20 min y tomar lectura
Temperatura de lectura °C 25 30 35 40 45 50 50 55 60 60
Enfriamiento desde 60 °C 10 min
Enfriamiento
Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura
Temperatura de lectura °C 55 50 45 40 35 30 25
Enfriamiento dedes 60 °C 20 min
Enfriamiento
Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura Estabilizar 3 min y tomar lectura
Temperatura de lectura °C 55 50 45 40 35 30 25
Durante el proceso se fueron registrando espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de la proteína (λ emisión 300 a 550 nm; λ excitación 280 nm correspondiente a la fluorescencia del triptófano; slits 2; incremento 1nm). Las lecturas se realizaron en cubeta de cuarzo de 1 cm de espesor.
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3.5 Determinación de actividad enzimática y parámetros cinéticos de α-glucosidasa en miel 3.5.1 Determinación de actividad α-glucosidasa en miel
Se utilizó el procedimiento descripto en el punto 3.3.1. La solución de prueba se preparó pesando 5 g de miel y diluyendo con solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0) hasta 25 ml. Las muestras se incubaron por 20 min a 40 °C en un baño termostatizado con una variación ± 0,5 °C. Las determinaciones se realizaron como mínimo por triplicado. En la Tabla 6 se detalla la construcción de la muestra para esta determinación.
Tabla 6: Detalle de la construcción de cada muestra para la determinación de la actividad de la glucosidasa de la miel.
Reactivos
Sustrato 0,02 M Solución de miel 5 g/25ml Tris 3 M, pH 9,5 Volumen total
Volumen sistema experimental utilizado
420 µl 42,5 µl 42,5 µl 505 µl
En este caso, los valores de actividad enzimática se expresaron unidades internacionales (µmol/min/mg de proteína.) y también se expresaron en Número de Invertasa (NI) según la Ecuación (1), como se mencionó en la sección 3.3.1. El NI indica la cantidad de sacarosa por gramo hidrolizado en 1 hora por la enzima contenida en 100 g de miel en las condiciones del ensayo. Esta unidad fue elegida porque es de uso común.
NI = 21,64 x ΔA 400
(1)
Determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmax en miel Se utilizó el procedimiento descripto en el punto 3.3.1. La solución de prueba se
preparó pesando 1 g de miel y diluyendo con solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0) hasta 5 ml. Para esta determinación se preparó una solución concentrada de sustrato (pNPG) de 0,02 M utilizando como disolvente solución buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0). Las incubaciones fueron realizadas a 40 °C por 20 min. En la
Tabla 7 se muestra cómo fueron construidas las muestras para esta experiencia.
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A partir de los valores de absorbancia se calculó la actividad específica como unidades internacionales (µmol/min/mg de proteína) y se graficó en función de la concentración de sustrato. Los valores de Vmax y Km fueron calculados ajustando los datos experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten (Fennema, O., 2010).
Esta experiencia sólo se realizó con la muestra de miel M1.
Tabla 7: Construcción de cada muestra para la determinación de la curva de actividad enzimática en la miel M1.
Reactivos
Sustrato 0,02 M (µl) Miel 1g/5ml (0,2 g/ml) Buffer-fosfato 0,1 M, pH 6,0 (µl) Tris 3M, pH 9,5 (µl) Volumen total (µl)
0,0002 10,0 85,0 821 84,0 1000
0,0003 15,0 85,0 816 84,0 1000
0,0006 30,0 85,0 801 84,0 1000
Concentración pNPG (M)
0,0009 45,0 85,0 786 84,0 1000
0,0015 75,0 85,0 756 84,0 1000
0,0030 150 85,0 681 84,0 1000
0,0060 150 42,5 266 42,0 500
0,0090 225,00 42,5
191 42,0 500
0,0120 300,00 42,5
116 42,0 500
0,0170 420,00
42,5 0
42,0 505
3.6 Tratamiento térmico de mieles simulados en laboratorio Para observar el efecto en la actividad de la α-glucosidasa de la miel después de la
aplicación de un tratamiento térmico similar a los utilizados en los procesos industriales, las mieles recibieron 10 tratamientos térmicos (combinación de tiempo y temperatura) simulados en laboratorio. Los tratamientos consistieron en someter a la miel a un proceso de precalentado (tomado como referencia de licuado/homogeneizado de miel), calentado (tomado como referencia del proceso de calentado/pasteurización de miel) y enfriado en condiciones controladas según el esquema mostrado en la Tabla 8.
Tabla 8: Construcción del experimento de los 10 tratamientos térmicos usados en mieles.
Precalentado
N° Temperatura
trat. (°C)
1
50
2
50
3
50
4
50
5
50
6
50
7
50
8
50
9
50
10
50
Tiempo (min)
30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
Calentado
Temperatura (°C) 70 70 70 70 70 70 60 60 60 60
Tiempo (min) 1,50
3 5 10 15 20 5 10 15 20
Enfriado
Temperatura (°C) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40
Tiempo (min) suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente suficiente
Almacenado
Temperatura Tiempo
Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente Ambiente
hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis hasta análisis
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Se prepararon 3 baños termostatizados con circulación de agua, y se ubicaron en forma secuencial. Los baños termostatizados se estabilizaron a 50 °C (baño I), 70 °C o 60 °C según el caso (baño II), y 40 °C (baño III). La temperatura se monitoreó mediante termómetro manteniéndose a ± 0,5 °C. El nivel de agua fue tal que permitió que la miel, contenida en los tubos, quedara completamente dentro del líquido. Las mieles fueron colocadas en tubos de Khan dejando un espacio de cabeza de aproximado de 1 cm, luego de lo cual se taparon para evitar la evaporación. Se colocó un termómetro digital con termopar dentro de uno de los tubos del grupo correspondiente a una serie para monitorear la temperatura en el interior del tubo durante la prueba como se muestra en la Figura 5. Los tubos se acomodaron en una gradilla y se sumergieron en el baño I de precalentado a 50 °C por 30 min. Transcurrido este tiempo, la gradilla fue retirada y colocada en el baño II donde se realizó el calentamiento a la temperatura y tiempo definido en la Tabla 8. Transcurrido el tiempo de calentamiento, la gradilla fue retirada y colocada en el baño II a 40 °C. Cuando la muestra alcanzó los 40 °C fue retirada para un enfriado a temperatura ambiente (temperatura de laboratorio) y almacenada en lugar fresco, sin luz y seco hasta el momento de realizar la determinación de actividad enzimática (punto 3.3.1). Los tratamientos se realizaron por duplicado y por triplicado según el caso. El tiempo de precalentamiento y calentamiento fue cronometrado.
Figura 5: Termopar digital y ubicación dentro de tubo de Khan con la muestra; y disposición de los tubos en la gradilla.
3.7 Adulteración de miel con jarabe mezcla y determinación de actividad α-glucosidasa 3.7.1 Adulteración de miel
Para esta determincaión se prepararon muestras de miel adulteradas con jarabe (10% P/P y 20 % P/P), para cada una de las mieles por tripicado. Las muestras se prepararon
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
pesando 4,5 g de miel y 0,5 g de jarabe diluyendo hasta 25 ml en buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0); y 4 g de miel y 1 g de jarabe diluyendo hasta 25 ml en buffer-fosfato (0,1 M, pH 6,0), para las adulteraciones del 10 % P/P y 20 % P/P, respectivamente. De igual modo se prepararon muestras control con 10 % P/P y 20 % P/P con agua destilada para poder comprobar que las posibles variaciones en la actividad enzimática son debido al agregado de azúcares invertidos y no por la dilución de las muestras. Se utilizó para adulterar jarabe mezcla marca Sucrodex. Las muestras así preparadas fueron conservadas en heladera hasta el momento de análisis. 3.7.2 Determinación la actividad de α-glucosidasa en mieles adulteradas
Para esta determinación se utilizó el método descripto en el punto 3.3.1. Las soluciones de prueba fueron las preparadas según el punto 3.7.1. Se preparó una solución concentrada de sustrato pNPG de 0,02 M utilizando como disolvente solución bufferfosfato (0,1 M, pH 6,0). En este caso la concentración final de sustrato en cada muestra fue de 9 mM. Se midió la actividad de la enzima en función de la temperatura, para evaluar si la presencia de adulterante afecta a la estabilidad de la enzima a altas temperaturas. Se incubó a 30, 40, 50 y 60 °C por 20 min. Las determinaciones se realizaron por duplicado. En la Tabla 9 se detalla la construcción de las muestras. Los resultados fueron expresados en actividad específica (µmol/min/mg de proteína) para poder comparar los resultados entre todas las mieles. Tabla 9: Construcción de las muestras para la determinación de adulteración.
Reactivos
Sustrato 0,02M Muestra 1g/5ml (control, 10% y 20 % adulterada) Tris 3M, pH9,5 Buffer-fosfato 0,1 M, pH 6,0 Volumen total
Volumen (µL)
225 42,5 42,5 190 500
3.8 Determinación de proteína en miel
La proteína en miel fue determinada por el método Bradford utilizando el kit de reacción Bio-Rad y realizando las lecturas por triplicado en placa de cultivo a 595 nm en
Espectrofotómetro Thermo Scientific (Bio-Rad Protein Assay, s.f.). Se utilizó albúmina sérica bovina en una concentración de 2 mg/L en agua destilada, a partir de la cual se prepararon
3 testigos (0,2 mg/ml, 0,8 mg/ml y 1,4 mg/ml) y se trazó una curva de calibración de mg/ml
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
de albúmina vs. A595nm. Los resultados fueron expresados en mg de proteína por gramo de miel. 3.9 Determinación de parámetros fisicoquímicos en mieles
Para conocer algunas características de las mieles utilizadas en este trabajo, se solicitó a un laboratorio externo la realización de las determinaciones. Los análisis fueron realizados en el INTI (Instituto Nacional de Tecnología Industrial).
A continuación, se mencionan las determinaciones realizadas y los métodos utilizados:
• Humedad refractométrica: ME 101 “Determinación de humedad refractométrica en miel” basado en Norma IRAM 15931:2007 “Miel. Determinación de la humedad por refractrometría”.
• Cenizas conductimétrica: ME 104 “Determinación de cenizas conductimétricas en miel” basado en Norma IRAM 15945:2007 “Miel. Determinación de la conductividad eléctrica”.
• Acidez libre: ME 109 A “Acidez libre en miel – A: Método con titulación manual y pH-metro” basado en Norma IRAM 15933:2013 “Miel. Determinación de la acidez libre”.
• Hidroximetilfurfural: AOAC N° 980.23, 16th Ed (1995). • Actividad diastásica: AOAC N° 958.09, 16th Ed (1995). • Actividad invertasa: Harmonised Methods of the International Honey Commission
(abril 2009). • Sólidos insolubles en agua: Norma IRAM 15936:2008 “Miel. Determinación de
sólidos insolubles en agua”. • Fructosa y glucosa: por HPLC
- Columna: Phenomenex Rezex RCM Monosaccharide - Precolumna: Carbo Ca - Fase móvil: H2O - Flujo: 0,6 ml/min - Detector: Índice de refracción a 70 °C • Sacarosa: por HPLC - Columna: Kromasil KR100-5NH2; 250 x 4,6 mm
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
- Precolumna: Phenomenex NH2; 4 mmL x 3,0 mm ID - Fase móvil: AcN: H2O : 70 : 30 - Flujo: 1,0 ml/min - Detector: Índice de refracción a 30 °C
3.10 Análisis estadístico de resultados y gráficos Los datos fueron graficados y analizados estadísticamente utilizando el software
InfoStat v. 2018 y el software SigmaPlot v. 12.5. Se estimaron medias y desvíos estándares. Se realizaron análisis de varianza y test de separación de medias (LSD) y test t de Student para un nivel de significancia α = 0,05. Las unidades de medida y los símbolos utilizados corresponden al Sistema Internacional de Unidades-SI (Oficina Internacional de Pesas y Medidas, 2008).
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Características fisicoquímicas de las mieles estudiadas En la Tabla 10 se muestran los valores obtenidos para el análisis de las mieles del
Dpto. de Cruz del Eje (Córdoba) utilizadas en este estudio. La cantidad de hidroximetilfurfural (HMF) (< 1 mg/kg) y la actividad diastásica ( 8 ND) permiten comprobar la frescura y calidad de estas mieles. Estos resultados son similares a los reportados por otros autores para mieles frescas y no adulteradas del noroeste de Córdoba (Baroni M.V., et al., 2009). Además, las mieles cumplen con los requisitos de calidad establecidos por el art. 783 del CAA, la Resolución GMC Nº 015/94 y el CODEX STAN 121981 para humedad refractométrica, cenizas conductimétricas, acidez libre, HMF, actividad diastásica, sólidos insolubles en agua y sacarosa aparente.
En el Apéndice 3 se muestra una tabla comparativa de los valores de referencia utilizados.
Es necesario mencionar que este tipo de análisis no ofrece información sobre el origen botánico de las mieles.
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40
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Tabla 10: Caracterización físico química de las mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
Determinaciones M1
(2)Humedad refractométrica (g/100g)
14,9 0,1
Muestras
M2
M3
15,4 0,1 14,9 0,1
M4 14,3 0,1
(2)Cenizas conductimétricas (mS/cm)
0,563 0,036 0,412 0,023 0,673 0,044 0,707 0,047
(2)Acidez libre (meq/kg) 8,68 ± 1,97 7,35 ± 1,67 6,30 ± 1,43 5,36 ± 1,22
(2)Hidroximetilfurfural
<1
<1
<1
<1
(mg/kg)
Requisito normativo
(3)Máximo 18
(4)Miel de flores: máx. 0,8
(4)Miel de mielada: mín. 0,8
(3)Máximo 40
(3)Máximo 40
(1)Composición mieles
NO Cba. 17,4 ± 0,8 15,8 - 18,8
22,8 ± 11,2 10,1 - 52,2 0,54 ± 0,41 0,05 - 1,52
(3)Mínimo 8
(2)Actividad diastásica ND (escala Gothe)
16,9
14,2
11,1
18,0
(3)Miel con un contenido bajo de enzima natural, mínimo 3
17,9 ± 6,7 8,9 - 31,8
(siempre que el HMF sea < 15
mg/kg)
(2)Actividad de invertasa NI
14,13 ± 0,03
10,93 ± 0,88
14,50 ± 0,57
11,53 ± 0,38
(5)Recomendado: mínimo 10, mieles con baja actividad enzimática mínimo 4
\_\_
(2)Sólidos insolubles en agua (g/100g)
0,056
(2)Sacarosa aparente (g/100g)
< 0,1
0,045 0,17
0,061 < 0,1
(3)Máximo 0,1
0,087
(3)Miel prensada máx. hasta
\_\_
0,5
(3)Miel de flores: máx. 8
1,7
(3)Miel de mielada y mezcla
\_\_
de miel de mielada y miel de
flores: máx. 10
(2)Fructosa (como fructosa) (g/100g)
40,6
38,9
40,7
37,6
\_\_
37,2 ± 4,2 27,5 - 44,3
(2)Glucosa (como glucosa anhidra) (g/100g)
31,4
31,6
30,4
27,3
\_\_
29,4 ± 3,7 21,5 - 34,7
(6)Proteinas (Bradford) (mg/kg)
623,1
286,7
400,6
450,2
\_\_
322 ± 145 168 - 708
(1): Composition of honey from Córdoba (Argentina): Assessment of North/South provenance by chemometrics (Baroni, et al ., 2009)
(2): Laboratorio INTI-Agroalimentos. Los resultados de humedad refractométrica, cenizas conductimétricas y acidez libre corresponden a la media ± la incertidumbre para un 95 % de confianza para k=2. Los resultados para actividad de invertasa corresponden a la media ± una vez la desviación estándar. (3): CAA - Capítulo X (4): CODEX STAN 12-1981 (5): Honey quality and international regulatory standards: review by the international honey commission (Bogdanov, et al. , 1999). Los resultados corresponden a la media ± una vez la desviación estándar.
(6): Realizados en este trabajo.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
4.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estructura de la enzima α-
glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae
4.2.1 Cinética de la α-glucosidasa purificada
Se estudió la cinética de la enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce
cerevisiae (Tipo I) con el objetivo de poner a punto y adaptar el protocolo de trabajo
(método recomendado por la IHC) a volúmenes pequeños. Trabajar con volúmenes
pequeños no solo permitió economizar reactivos sino también tiempo al poder medir
muchas muestras de manera simultánea utilizando un espectrofotómetro con lector de
placas.
Determinación de la concentración de producto (pNP-)
El pNP- (4-nitrofenolato) es el producto obtenido de la descomposición del pNPG por
la acción catalítica de la enzima α-glucosidasa. La determinación del coeficiente de
extinción molar del pNP- (εPNP-) permitió utilizar la Ley de Lambert y Beer para cuantificar
la cantidad de producto formado durante el proceso de catálisis enzimática. La cantidad de
producto es equivalente a la cantidad de sustrato utilizado (pNPG).
Se registró el espectro de absorción de producto de la reacción catalizada por α-
glucosidasa (pNP- = 20,5 µM) disuelto en una mezcla buffer-fosfato y Tris-HCl (92 % buffer-
fosfato y 8 % Tris-HCl) y pH final de 9,0. Se trazó la línea de base con la mezcla de buffer-
fosfato y Tris-HCl y luego se registró el espectro de absorción entre 250 nm y 600 nm con
el Espectrofotómetro Beckman. Se determinó una longitud de onda de máxima absorción
(λmax) de 400 nm confirmando lo definido en el método 9 de la IHC (Harmonised Methods
of the International Honey Commission, 2009).
Para determinar el coeficiente de extinción molar del pNP- (εpNP-) en solución buffer-
fosfato y Tris-HCl se prepararon soluciones testigos a partir de una solución madre de pNP
y se construyeron las curvas de calibración midiendo la absorbancia a 400 nm en cubeta de
vidrio y en placa de cultivo de 96 wells. El coeficiente de extinción molar εpNP- se calculó
como la pendiente de la recta de absorbancia vs. concentración de pNP- según la Ley de
Lambert y Beer (Kolthoff, et al., 1979). La fórmula es mostrada en la Ecuación (2).
= ∗ ∗
(2)
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Siendo: C: concentración de pNPb: paso óptico ε: coeficiente de extinción molar del pNP-
El valor de εnNP- para cubeta de vidrio de paso óptico de 1 cm fue 19290 M-1cm-1 (Figura 6, a). El valor de εnNP- para placa de cultivo de 96 wells, volumen 200 µL y un paso óptico de 0,505 cm (calculado geométricamente) fue de 19634 M-1cm-1 (Figura 6, b). Los valores hallados de coeficiente de extinción molar, paso óptico y longitud de onda de mayor absorción del pNP-, se utilizaron en todas las pruebas realizadas, tanto con la enzima purificada de Saccharomyce cerevisiae como con la enzima de la miel.
A400nm A400nm
Pendiente = b; b=1 cm
a)
2,0 Pendiente = 19290 ± 138; R2=0,99
= 19290 M-1cm-1
1,5
Pendiente = b; b=0,505 cm
b)
2,0 Pendiente = 9915 ± 210; R2=0,99
= 19634 M-1cm-1
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0 0
2e-5
4e-5
6e-5
8e-5
0,0 0
5e-5 1e-4 2e-4 2e-4
pNP (M)
pNP (M)
Figura 6: Curva de calibración de pNP- en medio buffer-fosfato y Tris-HCl pH 9,0 a 24 °C. a) Cubeta de vidrio de 1 cm de paso óptico. b) Placa de cultivo de 96 wells, volumen de 200 µL y
paso óptico 0,505 cm.
Determinación de las condiciones de trabajo a velocidad inicial (Modelo de MichaelisMenten).
El comportamiento general de la mayoría de las reacciones enzimáticas sigue el mecanismo descripto por Michaelis-Menten en 1913, es también el caso de las glucosidasas de Saccharomyce cerevisiae (maltasa) y de la de Apis mellifera (variante III) presente en la miel (Yoshikawa 1994 y Nishimoto 2001). Cuando comienza la reacción, la velocidad aumenta en forma proporcional a la generación de producto en los primeros momentos de la reacción, esto se da cuando se ha consumido menos del 5 % de sustrato, es en esta zona que hablamos de velocidad inicial. Cuando toda la enzima está saturada de
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
sustrato, la enzima funciona al máximo, continuamente se forma el complejo enzima-
sustrato, se genera el producto y se libera la enzima, pero la reacción inversa (k-2) aún no ocurre. El sistema llega al estado estacionario en donde la velocidad de formación de
producto es constante y máxima (Fennema, O., 2010). Un esquema general de una reacción
enzimática se puede ver en la Ecuación (3).
Siendo:
k1
k2
E+S
E.S
E+P
(3)
k-1
k-2
E = enzima
S = sustrato
P = producto
k1 = velocidad de reacción del complejo E.S k-1 = velocidad de desaparición del complejo E.S k-2 = velocidad de formación del complejo E.S después de la formación del producto. Otro de los supuestos del modelo de Michaelis-Menten que se debe cumplir para poder aplicarlo
es que esta velocidad sea cero.
La relación entre la velocidad y la concentración de sustrato está expresada por la
ecuación Michaelis-Menten (4) respondiendo a una relación hiperbólica.
=
∗ [ ] + [ ]
(4)
Siendo: : velocidad media experimental Vmax: velocidad máxima de reacción Km: constante Michaelis – Menten [S]: concentración de sustrato
El valor de Km (constante Michelis-Menten) es un valor característico para cada enzima con su sustrato específico y corresponde a la concentración de sustrato cuando se llega a la mitad de la velocidad máxima (Vmax). Es un indicador de la afinidad de esa enzima por el sustrato y viceversa. Cuanto más pequeño es Km mayor afinidad existe por el sustrato (Nilsen, 2003).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
=
−1 + 1
2
(5)
La Vmax representa el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por molécula de enzima cuando la misma está saturada de sustrato. Esta velocidad es característica para una enzima a una concentración específica de ella. Curva de tiempo
Se realizaron dos curvas, a dos concentraciones de sustrato pNPG (0,6 mM y 17 mM) y a una concentración constante de enzima (5 µg/ml de α-glucosidasa) en buffer- fosfato (0,1 M, pH 6,0). La reacción transcurrió a 40 °C y se detuvo por el agregado de Tris-HCl (3M, pH 9,5). Se midió la A400nm cada 5 min, durante 30 min.
En la Figura 7 podemos observar que hasta los 25 min de incubación la relación entre velocidad (como formación de producto) y tiempo es lineal, lo que sugiere que ese es el límite de tiempo para mantener la reacción en la zona de velocidad inicial.
pNP (M)
3e-4
3e-4
0,017 M
0,0006 M
2e-4
2e-4
1e-4
5e-5
0
0
10
20
30
Tiempo (min)
Figura 7: Curvas de tiempo para concentraciones de sustrato (pNPG) de 0,6 mM y 17 mM a concentración constante de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae enzima.
Concentración de enzima: 5 µg/ml, tiempos y temperatura de incubación: 5, 10, 15, 20, 25 y 30
minutos, 40 °C.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Se decide trabajar con la concentración de pNPG de 17 mM y un tiempo de incubación de 20 min para trabajar en condiciones de velocidad inicial (Harmonised Methods of the International Honey Commission, 2009). Curva de Enzima
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima dependerá de la concentración de la enzima en la mezcla de la reacción (Nilsen, 2003). Siguiendo el procedimiento establecido en el punto 3.3.1, se prepararon diversas diluciones de enzimas y se determinó la A400nm (como medida de la velocidad de reacción) manteniendo constante la concentración de sustrato, tiempo, temperatura y pH. Se graficaron los valores obtenidos para A400nm a las distintas concentraciones de enzima (Figura 8).
A400nm
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
-glucosidasa (µg/ml)
Figura 8: Relación entre la concentración de la enzima α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae y la A400nm como medida de velocidad de reacción.
La concentración de sustrato (17 mM de pNPG), la temperatura (40 °C) y el tiempo de incubación
(20 min) se mantuvieron constantes.
En la Figura 8 se puede observar que la concentración de enzima es directamente proporcional a la velocidad de reacción (relación lineal) hasta 10 µg/ml, máxima concentración ensayada. En base a los valores de absorbancia registrados y tomando en cuenta el rango de medición con mínimo error del espectrofotómetro se decidió trabajar
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
con la concentración de enzima de 5 µg/ml para la determinación de los parámetros cinéticos. 4.2.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae
Se midió la velocidad de formación de producto a diferentes temperaturas de incubación (30, 40, 50 y 60 °C) para evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae. En la Figura 9 se muestran las cuatro curvas de sustrato a las diferentes temperaturas. Se observa claramente que 40 °C es la temperatura óptima de actividad para la α-glucosidasa y que a valores superiores a los 6 mM de sustrato se produce una disminución de la velocidad lo que indicaría una posible inhibición por sustrato (Fennema, O., 2010). Se ajustaron las curvas a la ecuación de Michaelis-Menten, a concentraciones menores a aquellas en que ocurre la inhibición por sustrato, como se muestra en la Figura 10, para poder determinar Km y Vmax.
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
2,10
1,80
1,50
1,20
40 °C
0,90
30 °C
50 °C
0,60
60 °C
0,30
0,00
0,000 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018
Sustrato (M)
Figura 9: Curva de sustrato para la actividad de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de incubación de 30, 40, 50 y 60 °C. Concentración de enzima 5 µg/ml, tiempo de incubación 20 min.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
1,80 30 °C
1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00
Vmax = 0,781 ± 0,0145 mol/min/mg prot. Km = 1,057e-4 ± 1,186e-5 M R2 = 0,99
0,000
0,002
0,004
Sustrato (M)
0,006
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
1,80 40 °C
1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00
Vmax = 1,809 ± 0,042 mol/min/mg prot. Km = 2,194e-4 ± 2,324e-5 M R2 = 0,98
0,000
0,002
0,004
Sustrato (M)
0,006
1,80 50 °C
1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00
0,000
Vmax = 1,287 ± 0,059 mol/min/mg prot. Km = 2,709e-3 ± 2,591e-4 M R2 = 0,99
0,002
0,004
Sustrato (M)
0,006
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
1,80 60 °C
1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00
0,000
0,002
0,004
Sustrato (M)
0,006
Figura 10: Variación de la velocidad de formación de producto de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de incubación de 30, 40, 50 y 60 °C a distintas concentraciones de pNPG. Concentración de enzima 5 µg/ml, tiempo de incubación 20 min.
En función de los resultados experimentales se observa que el comportamiento cinético de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae sigue el modelo de Michaelis-Menten para las temperaturas de 30, 40 y 50 °C, por debajo de una concentración de sustrato de 6 mM. A 60 °C la enzima pierde totalmente la capacidad para hidrolizar al sustrato.
Del ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten se determinaron los parámetros cinéticos Km y Vmax. Como se puede ver en la Tabla 11 y en la Figura 11, la temperatura óptima para esta enzima es 40 °C ya que a dicha temperatura se registra la mayor actividad enzimática (Vmax de 1,81 ± 0,04 µmol/min/mg de proteína). Los valores de Vmax disminuyen a medida que aumenta la temperatura después de los 40 °C lo que sugiere una menor cantidad de enzima activa a mayor temperatura. El valor de Km obtenido a 40 °C (0,22 ± 0,02 mM) está de acuerdo con lo reportado por otros autores en condiciones similares (Yamamoto, et al., 2004; Tabata, et al., 1984), sin embargo, no es posible comparar los valores de Vmax porque los métodos utilizados, si bien utilizan el mismo sustrato, no son iguales; no son descriptos detalladamente en la bibliografía o no fueron expresados con unidades internacionales.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Por encima de los 40 °C se observó la pérdida de actividad y disminución de la afinidad (aumento de Km), por desnaturalización de la proteína debido al efecto de la temperatura. Tabla 11: Vmax y Km obtenidos experimentalmente para temperaturas de incubación 30, 40, 50 y 60°C para la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae.
Temperatura (°C)
30 40 50 60
V max ± EE (µmol/min/mg prot.) 0,78 ± 0,01 1,81 ± 0,04 1,29 ± 0,06 ---
Km ± EE (mM) 0,11 ± 0,01 0,22 ± 0,02 2,71 ± 0,26 ---
Vmax ( mole/min/mg prot.)
2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
20
30
40
50
60
70
Temperatura (°C)
Figura 11: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática y la afinidad de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae para la hidrólisis de pNPG. La línea de puntos azul
señala la temperatura óptima para la enzima.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
4.2.3 Efecto de la temperatura sobre la estructura de la α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae
La fluorescencia intrínseca de una proteína resulta de la fluorescencia individual de los residuos aromáticos que se encuentran formando parte de su estructura y de la interacción de estos con su entorno. La mayoría de las emisiones fluorescentes intrínsecas de una proteína plegada se deben a la excitación de los residuos de triptófano, con algunas emisiones debido a la tirosina y fenilalanina. El triptófano tiene una longitud de onda de máxima absorción de 280 nm y su pico de emisión va desde 300 a 350 nm dependiendo de la polaridad del medio ambiente local (el pico se corre a mayores longitudes de onda cuando el ambiente es más polar), por lo que puede ser usada como indicador de los microambientes del triptófano y por ende de cambios en el plegamiento de la proteína que modifiquen su microambiente (Nilsen, 2003).
Es decir, cuando una proteína se encuentra en su estado de conformación nativoplegada en medio acuoso, los triptófanos que forman parte de su estructura se encuentran más o menos expuestos al solvente acuoso polar, según su localización en la estructura tridimensional de la proteína. Si por algún motivo, la proteína sufriera cambios en su estructura, los triptófanos que estaban protegidos en el corazón hidrofóbico de la estructura podrían quedar más expuestos al medio acuoso lo que llevaría a un corrimiento del espectro de emisión, permitiendo sugerir la desnaturalización de la proteína (Santos, 2009).
Con el objetivo de evaluar el efecto del aumento de la temperatura sobre la estructura de la enzima, se midió la fluorescencia intrínseca de -glucosidasa Saccharomyce cerevisiae (Tipo I, 0,1 mg/ml en solución buffer-fosfato) a lo largo del proceso de calentamiento y para determinar si el efecto observado era reversible, también se registraron espectros en el proceso de enfriamiento. Además, para simular el tratamiento que recibe la enzima que se encuentran en la miel, se incluyó en el trayecto de calentamiento una incubación a 50°C por 30min (precalentado) y al llegar a 60°C se mantuvo a dicha temperatura durante 10 min o 20 min antes de comenzar el ciclo de enfriamiento, para emular la pasteurización.
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Las gráficas de la Figura 12 nos muestran espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de -glucosidasa de Saccharomyce cerevisiae registrados durante el proceso de calentamiento. Se observó que a 25 °C el pico máximo de intensidad de florescencia (max) ocurrió a los 351 nm. El aumento de la temperatura indujo la disminución de la intensidad de fluorescencia respecto a la observada a 25 °C y un corrimiento batocrómico del espectro, es decir hacia valores mayores de (de menor energía).
IF ( ex= 280 nm)
2,5e+5 2,0e+5 1,5e+5 1,0e+5 5,0e+4 0,0
25 °C 30 °C 35 °C 40 °C 45 °C 50 °C 50 °C 30 min 55 °C 60 °C 60 °C 10 min Buffer
300 320 340 351 360 380 400 420 440
(nm)
IF ( ex 280 nm)
3,0e+5 2,5e+5 2,0e+5 1,5e+5 1,0e+5 5,0e+4
25 °C 25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C 50°C 30 min 55°C 60°C 20 min Buffer
0,0 351
300 320 340 360 380 400 420 440
(nm)
Figura 12: Espectros de fluorescencia intrínseca de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae durante el proceso de calentamiento. En los gráficos se indica el pico máximo de IF a 25 °C.
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Se graficó el porcentaje de intensidad de fluorescencia a 351 nm respecto a la IF inicial a 25 °C incluyendo el proceso de calentado y enfriado y se calculó el % de disminución de la intensidad de fluorescencia. En estos gráficos (Figura 13) se observa claramente como disminuye la IF con el aumento de la temperatura y cómo no se recupera dicha IF al volver a la temperatura inicial.
% IF = 351 nm resp. a 25 °C
120
100
80
Col 1 vs IF351nm - IF351nm
a)
Calentamiento
60
40
20 20
Enfriamiento
30
40
* **
50
60
70
Temperatura (°C)
% IF = 351 nm resp. a 25 °C
120
b)
100
Calentamiento
80
60
40
20 20
Enfriamiento
30
40
* **
50
60
70
Temperatura (°C)
Figura 13: Porcentaje de variación de la intensidad de fluorescencia (IF) respecto a la IF a 25 °C de solución de α-glucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae.
a) Calentamiento máximo de 60 °C por 10 min indicado con dos asteriscos. b) Calentamiento máximo de 60 °C por 20 min indicado con dos asteriscos. El calentamiento a 50 °C por 30 min
indicado con un asterisco.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
En la Tabla 12: se muestran los valores representados en la Figura 13. Se puede observar que a medida que se aumentó la temperatura disminuyó el porcentaje de intensidad de fluorescencia llegando a valores similares en ambas experiencias (33,9 ± 0,9 % de IF a 60 °C por 10 min y 32,9 ± 2,7 % de IF a 60 °C por 20 min). Para decidir si las diferencias entre las medias observadas a 60 °C a 10 min y 60 °C a 20 min se pueden justificar por los errores aleatorios, se realizó una prueba se significancia mediante el test de Student (Miller, J.C. & Miller, J.N., 1993) no mostrando diferencias estadísticamente significativas en ambos valores (P=0,05). En el proceso de enfriamiento, se puede observar que a 25 °C no se logró recuperar los valores de IF iniciales, pero dado que la intensidad de fluorescencia del triptófano (uno de los aminoácidos de residuos aromáticos que genera fluorescencia) disminuye con la temperatura, independientemente de si ocurren cambios en su entorno (Lakowicz, 2006), los porcentajes de disminución de IF no pueden atribuirse exclusivamente a la pérdida de estructura. En función de esto, la posición del espectro (máx) resulta un parámetro más exacto para evaluar los cambios en el entorno del triptófano por desnaturalización de la proteína por efecto de la temperatura.
Tabla 12: Porcentaje de intensidad de fluorescencia (IF) respecto a la IF a 25 °C de solución de αglucosidasa purificada a partir de Saccharomyce cerevisiae a temperaturas de calentamiento y enfriamiento.
Temp. (°C)
% IF ± EE (60 °C 10 min)
Calentamiento Enfriamiento
25
100
68,7 ± 0,4
30
88,8 ± 2,9
57,7 ± 8,0
35
87,3 ± 6,3
40
78,7 ± 7,5
45,6 ± 1,4
45
66,0 ± 3,3
50
58,1 ± 3,7
38,7 ± 1,9
50 *
49,6 ± 0,6
55
41,8 ± 0,9
60
36,0 ± 0,5
60 **
33,9 ± 0,9
* calentamiento por 30 min.
** calentamiento por 10 min o por 20 min
% IF ± EE (60 °C 20 min)
Calentamiento Enfriamiento
100
59,2 ± 2,6
87,0 ± 1,81
54,7 ± 2,0
77,8 ± 2,0
66,5 ± 6,3
47,4 ± 4,5
60,2 ± 2,3
48,5 ± 7,5
38,9 ± 5,1
49,4 ± 2,2
43,0 ± 2,6
36,7 ± 2,3
32,9 ± 2,7
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
54
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
La Figura 14 muestra la variación de máx con la temperatura. El corrimiento del espectro de emisión de fluorescencia intrínseca de la α-glucosidasa indica que el aumento de la temperatura desnaturaliza la proteína exponiendo los triptófanos a un entorno más polar y que ese cambio en la estructura de la proteína es irreversible ya que luego del proceso de enfriamiento no se recuperan los valores iniciales de máx. No se observan diferencias entre las incubaciones por 10 o 20 minutos a 60°C.
max (nm)
360 358 356 354 352 350 348 346 344 342
20
a)
Calentamiento Tratamiento Enfriamiento
30
40
50
60
70
Temperatura (°C)
360
b)
358
356
max (nm)
354
352
350
348
Calentam iento
Enfriamiento
346
Tratam iento
20
30
40
50
60
70
Temperatura (ºC)
Figura 14: Efecto del ciclo de calentamiento-enfriamiento sobre los valores de máx de espectros
de emisión de fluorescencia intrínseca de α-glucosidasa de Saccharomyce cerevisiae a): tratamientos a 50 °C por 30 min y 60 °C por 10 min
b): tratamientos a 50 °C por 30 min y 60 °C por 20 min
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
55
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
4.3 Efecto de la temperatura y tratamientos térmicos simulados en laboratorio sobre la actividad α-glucosidasa en miel 4.3.1 Cinética de la actividad α-glucosidasa en miel
Según lo reportado por Nishimoto et al. y Kubota et al., la principal α-glucosidasa de la miel corresponde a la α-glucosidasa III de Apis mellifera, la cual hidroliza sacarosa y pNPG ajustándose al modelo de Michaelis-Menten (2001; 2004). Además, estos autores, determinaron que el pH óptimo para esta enzima es 6 y la temperatura optima 40 °C.
En la Figura 15 se puede observar que la temperatura óptima de la enzima presente en las mieles de del Dpto. de Cruz del Eje de Córdoba es 40 °C, coincidiendo con el trabajo de Nishimoto y Kubota, y que a medida que aumenta la temperatura la actividad disminuye siguiendo un patrón similar al observado con la α-glucosidasa purificada a partir de la Saccharomyce cerevisiae mostrado en la Figura 11.
0,12
0,10
Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
20
30
40
50
60
70
Temperatura (°C)
Figura 15: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la α-glucosidasa en la miel M1. La línea de puntos azul señala la temperatura óptima para la enzima.
La Figura 16 a) muestra la curva de sustrato realizada a partir de la enzima presente en la miel M1, siguiendo el método descripto en el punto 3.3.1 donde se respeta la cantidad de enzima y el tiempo de reacción sugerido por Siegenthaler, y que son los mismos que adopta la IHC para realizar sus determinaciones de NI. En este caso, con el objetivo de
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
determinar los parámetros cinéticos de Km y Vmax, los valores fueron expresados como actividad específica previo la determinación del contenido de proteína por el método Bradford como se describió en el punto 3.8. El valor obtenido fue de 0,62 ± 0,22 mg proteina por gramo de miel.
Se observa que la curva de sustrato no alcanza claramente la meseta típica correspondente a la Vmax, posiblemente porque la concentración de sustrato máxima utilizada (17 mM) no fue suficiente. Es necesario aclarar que no fue posible utilizar concentraciones mayores de sustrato debido a la baja solubilidad de este en buffer-fosfato. Es por esto que, aparte de ajustar los datos experimentales a la ecuación de Michaelis Menten, para obtener los parámetros cinéticos también se realizó el gráfico de las dobles reciprocas de Lineaweber-Burk (Fennema, O., 2010) mostrado en la Figura 16 b).
A partir del ajuste de los datos experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten se determinó el valor de Vmax = 0,17 ± 0,01 µmol/min/mg prot. que refleja la cantidad de enzima activa en la miel M1 y el valor de Km = 7,11 ± 0,95 mM que muestra la afinidad de la enzima por el sustrato artificial pNPG. A partir del gráfico de Lineawever-Burk se determinaron los siguientes valores para los parámetros cinéticos Vmax= 0,13 µmol/min/mg prot. y Km= 5,73 mM.
Los valores obtenidos de Vmax y Km fueron inferiores a los reportados por diversos autores para esta enzima, pero purificada a partir de abejas (Kubota M., et al., 2004; Nishimoto, M., et al., 2001) o purificada a partir de mieles (Pontoh, 2001; Huber R. E & Mathison R. D., 1976). Esto puede deberse principalmente a que los métodos utilizados por estos autores no siempre fueron los mismos a los utilizados en este trabajo, como así también, la enzima fue purificada. En este trabajo la enzima no fue purificada desde la miel, es decir que el medio en donde ocurrió la reacción fue distinto, y si bien, la afinidad por el pNPG de la enzima presente en la miel es muy alta, la enzima también podría estar hidrolizando, aunque en menor medida, la sacarosa presente estableciéndose un nuevo equilibrio en donde se hidroliza menos pNPG (Nishimoto, et al., 2001). Además de los azúcares y el agua, la miel contiene otras sustancias en menor proporción. Los ácidos orgánicos (predominantemente el ácido glucónico) que derivan de la transformación del néctar en azúcares o directamente del néctar dándole a la miel una leve acidez, se encuentra en una concentración aproximada del 0,6 % (da Silva, et all, 2016). Es sabido que
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
la actividad enzimática varía en función de la acidez. Nishimoto, et all, realizó el estudio para la α-glucosidasa tipo III purificada en su trabajo del 2001 determinando que el pH óptimo para la enzima era de 6. Por otro lado, en el trabajo de Baroni M.V., et all, del 2009 determinó que el pH de las mieles del NO de Córdoba estaba en el rango de 3,2 y 5,8, lo que puede sugerir que el pH natural de la miel está por debajo del pH óptimo. Sin embargo, para las determinaciones de actividad enzimática según el método utilizado en este trabajo, se regula la acidez mediante un buffer, siendo el pH de la reacción de 6 (pH óptimo para la α-glucosidasa), por tal motivo se descarta que los ácidos orgánicos pudieran influir en los resultados de actvidad. Otro factor que puede influenciar en la actividad enzimática son los compuesto fenólicos. En la miel existen más de 10.000 compuestos fenólicos identificados (flavonoides y no flavonoides) entre los cuales se encuentran la quercetina, la miricetina y el kaempferol (da Silva, et all, 2016). En un estudio se analizó la inibición de la α-glucosidasa de levaduras por parte de 16 flavonoides utilizando pNPG como sustrato, y se demostró que la quercetina, miricetina y el kaempferol tenían un efecto inhibidor de más del 50 % en esta enzima, siendo la quercetina el que produjo la mayor inhibición (8 µg produjo una inhibición del 50 %) (Iio, et all, 1984). En las mieles argentinas la concentración de compuestos fenólicos es de 700 a 800 µg expresados como ácido gálico por gramo de miel (Patrignani & Lupano, 2016). Sin embargo no contamos con reportes sobre el contenido específico de los diferentes falvonoides en las mieles del Dpto. de Cruz del Eje, por lo que no podemos asegurar que en la solución de reacción para la determinación de la actividad de la α-glucosidasa utilizada en este trabajo exista una inhibición apreciable producida por estos compuestos.
Analizar mayor cantidad de mieles permitiría caracterizar a las mieles de la región en cuanto al contenido de -glucosidasa.
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58
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
1/V
0,14
a)
0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
Vmax= 0,173 ± 0,010 mol/min/mg prot. Km= 0,0071 ± 0,001 M R2= 0,98
0,000
0,003
0,006 0,009 0,012
Sustrato (M)
0,015
0,018
300 b)
250
200
150
100
50
0 0
y =7,600 + 0,044 * x Vmax=0,132 mol/min/mg prot. Km= 0,006 M
1000
2000
3000
1/[S]
4000
5000
6000
Figura 16: Curva de sustrato para la actividad de α-glucosidasa de la miel a 40 °C para la miel M1. Concentración de miel 0,017 g/ml, tiempo de incubación 20 min. a) Gráfica Michaelis-Menten y b) gráfica Lineawever-Burk.
4.3.2 Efecto de tratamientos térmicos sobre la α-glucosidasa en miel Cuatro muestras de mieles de diferentes productores del Dpto. de Cruz del Eje,
fueron sometidas a tratamientos térmicos diferentes (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio según se describe en el punto 3.6 de materiales y métodos. Posteriormente se determinó la actividad α-glucosidasa según el método
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59
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
descripto en el punto 3.3.1 con el objetivo de observar el efecto de dichos tratamientos sobre la actividad enzimática y brindar sugerencias de los tiempos y temperaturas que afecten mínimamente la actividad de esta enzima, y de esa manera preservar la calidad de la miel.
Las mieles genuinas, sin ningún tratamiento térmico, fueron consideradas como muestra control. En este caso, la actividad enzimática se expresó como Número de Invertasa (NI).
En la Tabla 13 se muestran los valores obtenidos para el parámetro la actividad glucosidasa, expresado como Número de Invertasa (NI). Las cuatro mieles mostraron valores NI10, superiores al mínimo recomendado por la IHC, mínimo 10 NI (Bogdanov S., et al., 1999). Para valorar la calidad de las determinaciones de la actividad -glucosidasa en miel, realizadas en nuestro laboratorio, comparamos nuestros resultados con los obtenidos por un laboratorio de referencia (Instituto Nacional de Tecnología Industrial). Para decidir si las diferencias entre las medias obtenidas en nuestro laboratorio y las medias obtenidas por el laboratorio de referencia se pueden justificar por los errores aleatorios, se realizó una prueba de significancia a través del test de Student (Miller, J.C. & Miller, J.N., 1993). La media del valor de NI de la miel identificada como M3, mostró una diferencia estadísticamente significativa respecto al valor de la media de NI de la referencia (P=0,05), dando un valor levemente superior como se puede ver la Tabla 13. Esta diferencia se puede deber a errores de reproducibilidad y repetibilidad del método. Para este trabajo se adoptaron los NI obtenidos en nuestro laboratorio. A partir de estos resultados podemos decir que nuestro protocolo para medir actividad de -glucosidasa es confiable.
Tabla 13: Resultados obtenidos de NI para las cuatro mieles del Departamento de Cruz del Eje y valores obtenidos por el Laboratorio INTI-Agroalimentos.
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60
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Muestra
NI Obtenidos
NI Referencia
M1
13,8 ± 0,3
14,13 ± 0,03
M2
11,6 ± 0,1
10,93 ± 0,88
M3
15,9 ± 0,5
14,50 ± 0,57
M4
12,1 ± 0,4
11,53 ± 0,38
Los resultados corresponden a la media ± una desviación estándar.
En la Figura 17 y la Figura 18 se puede observar el efecto de los tratamientos térmicos
sobre la enzima presente en las cuatro mieles. Todas las mieles que recibieron tratamientos
térmicos experimentaron una reducción en la actividad de la α-glucosidasa respecto a la
muestra control, aunque la reducción fue característica de cada miel.
18 16 14 12
NI 10
8
a bb c
d
a bbb c
a
b b,c c
d
a b c dd
Control 60 °C 5 min 60 °C 10 min 60 °C 15 min 60 °C 20 min
6
4
2
0
M1
M2
M3
M4
Mieles
Figura 17: Gráfico de NI para el control y muestras con tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio a 60 °C y tiempos de exposición de 5, 10, 15 y 20
min con calentamiento previo de 50 °C por 30 min. Para cada grupo, las medias con una letra común no son significativamente diferentes para p≤0,05 (Análisis de varianza con test a posteriori LSD de Fisher). La línea de puntos azul señala el valor mínimo recomendado internacionalmente de
NI.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
61
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
18 16 14 12
NI 10
8
a
a b
b,c cc
dd
a
b c de ff
bbb b
cc
a b,c b d,e c,d c,d
e
Control 70 °C 1 min 30 s 70 °C 3 min 70 °C 5 min 70 °C 10 min 70 °C 15 min 70 °C 20 min
6
4
2
0
M1
M2
M3
M4
Mieles
Figura 18: Gráfico de NI para el control y muestras con tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio a 70 °C y tiempos de exposición de 1 min 30 s, 3, 5, 10, 15 y 20 min con calentamiento previo de 50 °C por 30 min. Para cada grupo, las medias con una letra común no son significativamente diferentes para p≤0,05 (Análisis de varianza con test a
posteriori LSD de Fisher). La línea de puntos azul señala el valor mínimo recomendado internacionalmente de NI.
En el Apéndice 4 se muestra el efecto en la actividad enzimática de los tratamientos aplicados en cada miel por separado (M1, M2, M3 y M4). Las medias muestrales de NI del control y todas las medias de NI de las mieles con tratamiento fueron graficadas y se confeccionaron tablas en orden decreciente de NI en función de los resultados experimentales. Como se pudo comprobar según los resultados individuales (Apéndice 4), el efecto de la temperatura (60 °C y 70 °C) a distintos tiempos de exposición y con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min aplicado a cada miel, llevó a una disminución irreversible de la actividad enzimática de la -glucosidasa en todos los casos y, dependiendo del valor inicial de actividad enzimática, esta disminución estuvo por debajo del valor recomendado internacionalmente, mínimo 10 NI (Bogdanov S., et al., 1999). Además, se ensayó el protocolo sugerido por el fabricante del pasteurizador Farli (68-72 °C por 1min 30 s). La experiencia realizada en este trabajo a 1 min 30 s con un calentamiento previo de 50 °C por 30 min (proceso de precalentamiento/homogeneizado) llevó a una disminución de entre el
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62
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
14 al 22 % del NI llevando ese valor al límite de tolerancia, esto se puede ver en la Tabla 14.
Tabla 14: Porcentaje de disminución de la actividad enzimática en mieles después de recibir
tratamientos térmicos simulados en laboratorio.
% de disminución de la actividad enzimática
Tratamiento térmico
60 °C 20 min* 70 °C 1 min 30 s** 70 °C 15 min* 70 °C 20 min*
M1
32,2
21,0
52,1
50,7
M2
36,2
18,1
39,8
40,1
M3
40,1
22,1
34,2
31,5
M4
23,2
14,3
27,1
17,7
% disminución promedio
32,9
18,9
38,3
35,0
* Con calentamiento previo a 50 °C 30 min
** Protocolo pasteurizador simulado en laboratorio con calentamiento previo a 50 °C 30 min
En la Figura 19 se muestra comparativamente el efecto sobre la actividad de αglucosidasa, expresada como actividad específica en µmol/min/mg de proteína, de los tratamientos aplicados a 60 °C y a 70 °C a tiempos iguales (5, 10, 15 y 20 min) para cada miel. Para ello, previamente se determinó la cantidad de proteína de las cuatro mieles por el método Bradford descripto en el punto 3.8 y los resultados se muestran en la Tabla 10.
En base a la Figura 16 podemos decir que los valores graficados corresponden a valores de Vmax ([S]=17mM). Estos gráficos, al igual que la Figura 17 y la Figura 18, permiten observar la variabilidad que existe entre las mieles, lo que pone en evidencia la necesidad de trabajar con mayor cantidad de muestras para poder estimar los valores poblacionales de las mieles de esta zona. Sin embargo, es posible determinar que en todos los casos el tiempo de exposición a altas temperaturas lleva a la disminución de la actividad de la enzima en porcentajes diversos.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
63
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
0,021 M1
0,018
0,015 a
0,012
0,009
b
0,006
0,003 5
70 °C 60 °C
a a
a
b
b
b
10
15
20
Tiempo de tratamiento (min)
M3 a
0,021
0,018
a
0,015
0,012
0,009
0,006 5
a
a
a
b
a a
10
15
Tiempo de tratamiento (min)
70 °C 60 °C
20
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
M2
0,021
a
a
a
0,018
a
b
0,015
b
b
a
0,012
0,009 0,006
70 °C 60 °C
5
10
15
20
Tiempo de tratamiento (min)
M4
0,021
70 °C 60 °C
0,018
a
0,015
a
a
b
a
0,012
a
a
a
0,009
0,006
5
10
15
20
Tiempo de tratamiento (min)
Actividad enzimática específica ( mol/min/mg prot.)
Figura 19: Gráfico de puntos de actividad α-glucosidasa expresada como actividad específica según tratamientos a 60 °C y 70 °C a iguales tiempos (5, 10, 15 y 20 min) para las mieles M1, M2,
M3 y M4. Comparación de pares de datos para cada tiempo (5, 10, 15 y 20 min) y prueba de significancia a través del test de Student. Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Por último, se compararon todas las medias muestrales de NI (controles y todas las muestras tratadas térmicamente) de las cuatro mieles. Para identificar diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos se realizó un Análisis de Varianza con un diseño en bloque completos al azar, considerándose a cada miel un bloque y recibiendo cada bloque los mismos tratamientos (10 tratamientos y precalentamiento según lo mostrado en Tabla 8), y test LSD Fisher para evaluar diferencias significativas (Balzarini, y otros, 2012).
Al igual que en el análisis de las mieles individuales (Apéndice 4) la media muestral de NI de todas las muestras sin tratamiento (NI 13,3), fue el valor de mayor actividad αglucosidasa respecto a las medias muestrales de NI de todas las muestras que recibieron
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
64
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio. Las diferencias fueron estadísticamente significativas como se muestra en la Figura 20.
La menor disminución en la actividad α-glucosidasa se evidenció en las muestras que recibieron tratamientos térmicos a 60 °C por 5 min y 10 min con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min, con medias muestrales de NI de 11,8 y 11,3 respectivamente, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellas. Los porcentajes de disminución de la activad fueron de 11,7 % y 14,9 % para cada caso. La mayor disminución de la actividad αglucosidasa se evidenció en las muestras que recibieron tratamientos térmicos a 60 °C por 20 min y 70 °C por 15 y 20 min, no habiendo diferencias significativas entre las medias de NI de las muestras que recibieron los tratamientos a 60 °C por 20 min y 70 °C por 20 min y entre las muestras que recibieron los tratamientos a 70 °C por 15 y 20 min. Los porcentajes de disminución de la actividad fueron de 32,5 %, 38,1 % y 34,9 % para 60 °C por 20 min, 70 °C por 15 y 70 °C por 20 min respectivamente.
Podemos decir que, tratamientos a 60 °C por 20 min o tratamientos a 70 °C por 15 y 20 min, previo a un calentamiento a 50 °C por 30 min, implicó una reducción por debajo del valor recomendado internacionalmente, mínimo 10 NI, (Bogdanov S., et al., 1999) con una disminución porcentual de la actividad del 32,5 %, 38,1 % y 34,9 % respectivamente. Esto puede verse más claramente en la Tabla 15: NI de las muestras control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de las muestras con tratamientos térmicos para las cuatro mieles.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
65
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
NI
16
13,32
a
14
11,76 b 11,33
12
b; c 10,40 d
10,82 10,67 10,82 10,34 c; d d c; d d
8,99
8,24 8,67
10
e
f
e; f
8
6
4
2
0
Control 60
°C5
min 60
°C10
min 60
°C15
min 60
°C20 70
min °C 1
min
30
s 70
°C
3
min 70
°C
5
min 70
°C
10
min 70
°C
15
min 70
°C
20
min
Tratamiento
Figura 20: Gráfico de barra de NI para las muestras control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para las cuatro mieles.
Análisis de varianza (R2=0,87 y CV=7,40) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos
experimentales. Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05). La
línea de puntos señala el valor mínimo recomendado internacionalmente de NI.
Tabla 15: NI de las muestras control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de las muestras con tratamientos térmicos para las cuatro mieles. La línea de puntos señala el valor mínimo recomendado internacionalmente para NI.
Tratamiento
Temperatura
Tiempo
Media NI
EE
Significancia Disminución de
(p≤0,05)
actividad (%)
Control (sin tratamiento)
13,3
0,2
a
0,0
60 °C
5 min
11,8
0,3
b
11,7
60 °C
10 min
11,3
0,2
b; c
14,9
70 °C
5 min
10,8
0,2
c; d
18,8
70 °C
1 min 30 s
10,8
0,2
c; d
18,8
70 °C
3 min
10,7
0,2
d
19,9
60 °C
15 min
10,4
0,2
d
22,0
70 °C
10 min
10,3
0,2
d
22,4
60 °C
20 min
9,0
0,2
e
32,5
70 °C
20 min
8,7
0,3
e; f
34,9
70 °C
15 min
8,2
0,3
f
38,1
Nota: Análisis de varianza (R2=0,87 y CV=7,40) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
66
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Diversos trabajos han estudiado cómo afecta la temperatura a la calidad de la miel tanto en procesos de “pasteurización” como almacenamiento basándose principalmente en la actividad diastasa y el contenido de HMF entre otros (Tosi, et al., 2002; Tosi, et al., 2004; Turkmen, et al., 2006; Molino, et al., 2011; Escriche, et al., 2008; Escriche, et al., 2009; Adnan, et al., 2014). Los resultados respecto al estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad α-glucosidasa se refieren principalmente a mieles de otros países y los tratamientos o metodología de análisis fueron diferentes a los aplicados en este trabajo (Chua, L., et al., 2014; Lichtenberg-Kraag, 2012; Sramek, et al., 2016). Algunos han reportado reducciones de la actividad invertasa del 50 % y 75 % para tratamientos por una hora a altas temperaturas, 60 °C y 70 °C respectivamente (Dimins, F., et al., 2006), disminuciones entre el 50 % y hasta cerca del 70 % después de someter mieles de diversos orígenes florales a 55 °C por 24 h (Karabournioti & Zervalaki, 2001).
Gutierrez et al. presentó un estudio realizado en mieles argentinas mostrando el efecto de tratamientos térmicos simulados en laboratorio en la actividad α-glucosidasa donde se observó una disminucion de la actividad α-glucosidasa (15,8 %). Sin embargo este estudio se realizó en mieles florales de pradera (2011), diferentes a las estudiadas en este trabajo.
En cuanto a la evaluación del tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente, Orantes-Bermejo & Torre Fernandez-Piñar reportan una disminución de actividad αglucosidasa promedio de 33,4 % en miel de castaña después de 10 meses, y una disminución promedio de 28,1 % en miel de romero en el mismo período de tiempo (2009). Así mismo Vorlová & Pridal, pudieron comprobar un descenso de un 77,8 % de la actividad α-glucosidasa de mieles comerciales checas comparadas con mieles frescas (2002).
Se puede observar que el calentamiento o el tiempo de almacenamiento siempre tienen un efecto negativo en la actividad α-glucosidasa con variaciones según la temperatura, tiempo de exposición a una temperatura dada, el tipo de almacenamiento, la actividad enzimática inicial y el tipo o variedad de miel.
En base a los resultados obtenidos para las cuatro mieles del Dpto. de Cruz del Eje de Córdoba, podemos concluir que los tratamientos termicos que llevan a una disminucion del NI por debajo de 10, valor mínimo recomendado internacionalmente, son aquellos a 60 °C por más de 15 min y a 70 °C por más de 10 min. Se registró en promedio, una reducción
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
de la actividad α-glucosidasa del 33 % para las mieles que recibieron un tratamiento a 60°C por 20 min y un 38 % para las mieles que recibieron un tratamientos a 70 °C por 15 min y 20 min, con un un precalentamiento a 50 °C por 30 min y enfriamiento posterior en todos los casos. 4.4 Efecto de la adulteración de miel con jarabe mezcla en la actividad α-glucosidasa
Se realizó la experiencia descripta en el punto 3.7 con el objetivo de observar cómo afecta a la actividad de la α-glucosidasa el agregado de azúcares simples, y si puede ser considerada esta enzima un indicador de adulteración a través de un método rápido, fiable y menos costoso que otros métodos para identificar azúcares más complejos como las dextrinas provenientes de la producción de glucosa o fructosa a partir de granos de maíz.
Para poder comparar los resultados hallados para cada miel, los mismos fueron expresados en actividad específica, (µmol/min/mg de proteína). Para ello se determinó la concentración de proteínas en las cuatro mieles por el método Bradford según el método indicado en el punto 3.8 y los resultados se muestran en la Tabla 10. Las mezclas con 10 % P/P y 20 % P/P con agua destilada no representarían una variación en la composición de la miel, por lo que se esperan resultados similares a la muestra control.
El jarabe utilizado (Sucrodex) es una mezcla que posee en su composición fructosa y glucosa como principales componentes. En el Apéndice 6 se muestra el certificado de análisis suministrado por el fabricante. Este edulcorante es utilizado en la industria alimentaria para la elaboración de dulces y mermeladas, frutas escurridas y abrillantadas, licores, pulido de arroz, caramelos y conservas. Esta mezcla es de color claro y sabor dulce y estable a la temperatura, lo que permite almacenarse por largos períodos de tiempo a temperatura ambiente. Su menor precio, fácil disponibilidad y menor viscosidad en comparación con la miel, lo convierte en un buen candidato para ser utilizado como un adulterante, al igual que otros jarabes (jarabe de glucosa, jarabe de maíz de alta fructosa) de similares propiedades, los cuales son obtenidos de la hidrólisis del almidón del maíz. Como en su composición los azúcares principales son los mismos de la miel, es difícil de detectar su presencia. Para descartar la posibilidad de actividad enzimática, se realizó la determinación de actividad α-glucosidasa al jarabe mezcla según el método descripto en el punto 3.3.1 a 40 °C y 20 min de incubación, no detectando absorbancia de pNP-.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Se determinó la actividad α-glucosidasa a distintas temperaturas de incubación (30, 40, 50 y 60 °C) a las mieles genuinas (muestra control) y a las mieles rebajadas en un 10 % P/P y 20 % P/P con jarabe mezcla y con agua destilada, para luego graficar la actividad específica vs. la temperatura. Para decidir si las diferencias entre las medias de la muestra control y las medias de las muestras adulteradas son significativas, es decir se deben a errores aleatorios, se aplicó una prueba de significación entre pares de muestras correspondiente a una misma temperatura mediante la aplicación del test de Student (Miller, J.C. & Miller, J.N., 1993).
El incremento en la concentración de glucosa en las mieles adulteradas representó el 3,2 % P/P y 6,4 % P/P para las mezclas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe mezcla, respectivamente. El incremento en la concentración de fructosa en las mieles adulteradas representó el 3,8 % P/P y 7,6 % P/P para las mezclas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe mezcla, respectivamente. En la Tabla 16 y en la Tabla 17 se muestran las concentraciones finales de estos azúcares según las preparaciones realizadas para este estudio.
Tabla 16: Concentración de glucosa en mieles y jarabe mezcla, y las concentraciones finales de las mezclas realizadas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe.
Muestras
M1 M2 M3 M4 Jarabe
Glucosa g/100 g
31,4 31,6 30,4 27,3 32
Glucosa g/100 g 10 % jarabe 31,5 31,6 30,6 27,8
Glucosa g/100 g 20 % jarabe 31,5 31,7 30,7 28,2
Tabla 17: Concentración de fructosa en mieles y jarabe mezcla, y las concentraciones finales de las mezclas realizadas con 10 % P/P y 20 % P/P de jarabe.
Muestras
M1 M2 M3 M4 Jarabe
Fructosa g/100 g
Fructosa g/100 g 10 % jarabe
Fructosa g/100 g 20 % jarabe
40,6
40,3
40,1
38,9
38,8
38,7
40,7
40,4
40,2
37,6
37,6
37,7
38
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Todas las mieles exhibieron la mayor actividad α-glucosidasa a los 40 °C y una reducción abrupta de la actividad a los 50 °C y 60 °C teniendo un comportamiento similar al de la enzima purificada a partir de Saccharomyces cereviceae (punto 4.2.2). Las mieles M3 y M4, como se muetraen la Figura 21, tuvieron un comportamiento más cercano a lo esperado a temperaturas de 30, 40 y 50 °C, en comparación con las mieles M1 y M2 (Apéndice 5) donde no se evidencia claramente el efecto de la adulteración. Las diferencias en las mezclas con 10 % P/P de jarabe y la muestra control no son lo suficientemente grande como para rechazar que las diferencias observadas se deban a la variación aleatoria, sin embargo, se pueden observar diferencias significativas cuando la mezcla corresponde al 20 % P/P. Este efecto de reducción de la actividad enzimática por la presencia de azúcares simples podría asociarse a una inhibición por producto. Si bien la afinidad por el pNPG de la enzima presente en la miel es muy alta, la enzima también estará hidrolizando, aunque en menor medida, la sacarosa presente. El agregado de fructosa y glucosa podría estar estimulando la ocurrencia de las reacciones inversas, no solo de hidrólisis de pNPG sino también la de hidrólisis de sacarosa, estableciéndose un nuevo equilibrio en donde se hidroliza menos pNPG (Nishimoto, et al., 2001).
0,18
M3
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
Miel adulterada 10 % jarabe mezcla
0,02
Miel adulterada 10 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,18 a 0,16
a 0,14
0,12 b 0,10
a
M3
a
a
a b
0,08
b
0,06
0,04
Miel sin adulterar
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
0,02
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,14
M4
0,12 a a
0,10
b
0,08
0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 10 % jarabe mezcla
Miel adulterada 10 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,14
a
a
M4
0,12
a 0,10
b 0,08
a a
b
a
b 0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
Figura 21: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de las mieles M3 y M4 a distintas temperaturas de incubación (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 % P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P. Letras diferente y del mismo
color corresponden a las medias de actividad específica que mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P= 0,050).
En un estudio publicado por White et al. se evidenció que la actividad de la enzima -glucosidasa presente en la miel es inhibida por glucosa y que además posee la capacidad de transglicosilación formando trisacáridos (-maltosil -D-glucosido) adicionando una glucosa a la sacarosa (1953), sin embargo, el trabajo no describe cómo es el mecanismo de inhibición. Por otro lado, en el trabajo de Huber et al., donde se logra aislar la enzima αglucosidasa de la abeja melífera, también describe la capacidad de transglicosilación y no hubo efecto de inhibición por glucosa a concentraciones hasta 0,5 M en prueba realizada pNPG como sustrato a concentración de 0,02 M (1976).
La disminución de la actividad de -glucosidasa en la miel adulterada podría deberse también, a una propiedad alostérica de autoregulación de la α-glucosidasa inespecífica, pero esto podría ser poco probable según el trabajo Kubota et al. donde se estudiaron los tres tipo de α-glucosidasa presentes en la abeja Apis mellifera y la α-glucosidasa variante III, que es la enzima producida por la glándula hipofaríngea de la abeja y responsable de la conversión del néctar en miel, no presentó una comportamiento alostérico (2004).
Dado que el jarabe utilizado en nuestro trabajo contiene también maltosa, maltotriosa y restos de azucares, podríamos sugerir que están inhibiendo la hidrolisis de pNPG en el sitio activo de la enzima, teniendo en cuenta que la maltosa es reconocida como sustrato de la enzima aparte de la sacarosa y que se ha descripto la inhibición de la hidrólisis
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
de pNPG en presencia de trealosa (Huber R. E & Mathison R. D., 1976). No hemos encontrado reportes sobre el efecto de otros azucares sobre la hidrólisis de pNPG por la glucosidasa de la miel, este es un aspecto que debería evaluarse para echar luz sobre el mecanismo por el cual la enzima puede detectar la adulteración con este jarabe. La única forma de poder establecer que existe una inhibición por producto es a través de datos empíricos, lo que podría ser el objetivo de futuros trabajos.
En cuanto a la detección de una adulteración, se ha reportado el uso de métodos cromatográficos (HPLC) y espectroscópicos (FTIR) que resultan laboriosos y costosos para su implementación. Fattori et al., ha realizado una experiencia mediante TLC (cromatografía de columna de capa fina) para detectar adulteración de mieles mediante la cuantificación de maltodextrinas (polímero de la glucosa que aparece como resultado de la hidrólisis del almidón). En el estudio se realizaron mezclas de miel pura en distintas proporciones con jarabe de glucosa (1, 2, 5, 7 y 10 % P/P). Mediante este método la mínima detección de jarabe de glucosa fue de 0,5 % P/P (Fattori, et al., s.f.). En el trabajo no se especifica la concentración de glucosa de dicho jarabe, pero sí se puede inferir que, mediante métodos de TLC, es posible detectar pequeñas cantidades de este adulterante, sin embargo, es un método muy laborioso y costoso. Por su parte, Abdel-Aal, et al., propuso un método para detectar adulteración en base a la determinación de la viscosidad aparente de las mieles siendo capaz de detectar desde un 10 % P/P de nivel de adulteración de miel con JMAF (1993).
En principio no podemos decir que la actividad α-glucosidasa puede ser un indicador de adulteración cuando la adulteración es inferior al 20 % P/P. Sin embargo, la actividad de la enzima es capaz de detectar adulteraciones del 20 % P/P, lo que representa la detección de aproximada de 6 % P/P de glucosa proveniente del jarabe.
Los resultados obtenidos de esta experiencia muestran que la actividad de glucosidasa es un método sensible y prometedor para detectar la adulteración en mieles por el agregado de jarabes de maíz. Estos resultados no pueden ser tomados como concluyentes, pero es una primera aproximación al desarrollo de un método sencillo, considerando que no hay trabajos de este tipo realizados. Será necesario mejorar el diseño del experimento para incluir mayor cantidad de muestras en el ensayo, probar mayores
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
concentraciones de adulterante y evaluar la capacidad de otros azucares presentes en el jarabe para inhibir la hidrólisis del pNPG.
5. CONCLUSIONES
La temperatura óptima para la actividad de la enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae fue de 40 °C, por encima de esta temperatura la actividad de la enzima disminuye y puede explicarse por el cambio irreversible de la estructura de la proteína evidenciado por el incremento de max a temperaturas superiores a los 40 °C. Por otra parte, La temperatura optima de la enzima presente en la miel también fue de 40 °C y en base a la homología que presenta con la enzima de Saccharomyces cerevisiae. Proponemos que la enzima en la miel sufre cambios similares en su estructura ante la exposición a temperaturas mayores a 40°C.
Se ensayaron tratamientos térmicos que simulan los que experimentaría la miel en un proceso de extracción (precalentamiento a 50 °C por 30 min; pasteurizacion y enfriado) y se determinó el NI. Todas las mieles tratadas térmicamente experimentaron una disminución del NI respecto al control (miel sin tratamiento térmico). Los tratamientos que llevaron a una disminucion del NI por debajo de 10 (mínimo recomendado internacionalmente), fueron aquellos a 60 °C por más de 15 min y a 70 °C por más de 10 min. El promedio de la reducción de la actividad α-glucosidasa fue del 33 % para las mieles que recibieron un tratamiento a 60 °C por 20 min y un 37 % para las mieles que recibieron un tratamientos a 70 °C por 15 y 20 min.
En función de los resultados de este trabajo, se recomienda que en los procesos de “pasteurización” convencionales se establezcan protocolos estandarizados teniendo en cuenta: valores iniciales de NI, el volumen de miel, forma de homogeinización (o mezclado), la temperatura y tiempo de exposición durante los tratamientos térmicos para evitar sobrecalentamientos, recomendando el uso de temperaturas no mayores a los 60 °C por más de 15 min. Así mismo, para los sistemas de “pasteurización” a alta temperatura-corto tiempo, se recomienda la implementacion de protocolos estandarizados teniendo en cuenta: los valores iniciales de NI, temperatura y velocidad de “pasteurización” recomendando no superar los 70 °C por más de 10 min. En ambos casos, para la definición de un protocolo, es conveniente tomar muestras antes y después de los tratamientos y
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
confirmar, mediante determinación de NI, que el proceso no provoca disminución de la actividad enzimática por debajo de los 10 NI. Para los casos de mieles de baja actividad enzimática natural, el valor recomendado de NI no debe ser inferior a 4 (Bogdanov S., et al., 1999), pero este no sería el caso de mieles del Noroeste de Córdoba.
Finalmente, la actividad α-glucosidasa de la miel permitió distinguir la adulteración de la miel a partir del 20 % P/P de jarabe.
6. PROYECCIONES FUTURAS
En virtud del trabajo realizado, y comprendiendo que aún hay aspectos a desarrollar con mayor profundidad, se plantean los siguientes temas a abordar en trabajos futuros:
- Actividad α-glucosidasa característica de las mieles de la región: incrementar el número de muestras a analizar a fin de lograr información representativa de las mieles de la región.
- Actividad α-glucosidasa como indicador de la adulteración de miel por el agregado de azúcares invertidos: ensayar otros adulterantes, combinaciones de diversos adulterantes y concentraciones de estos.
- Efecto de la temperatura en la cinética y estructura de la α-glucosidasa de la miel: purificar la enzima de la miel y comparar la actividad a distintas temperaturas de la enzima purificada con la actividad de la enzima en la miel. Determinar la fluorescencia intrínseca a diversas temperaturas de calentamiento y enfriamiento de la enzima purificada de la miel para comprobar la recuperación o no de la actividad enzimática.
- Composición de flavonoides en las mieles.
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
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Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
APÉNDICES
Apéndice 1: Diagrama de flujo de procesamiento y fraccionamiento de miel
Recepción, descarga y almacenamiento de alzas
Marco con miel, cera e impurezas
Desoperculado
Restos finos de cera e impurezas
Escurrido y Extracción
Miel, cera e impurezas
Tamizado
Miel, cera e impurezas
Depósito
Miel, cera e impurezas
Decantado
Miel
Pasteurizado (opcional)
Filtrado (opcional)
Marco sin miel Miel, cera e impurezas
Miel, cera e impurezas
Miel, cera e impurezas
Fraccionado
Envasado a granel
Depósitos frascos
Depósito tambores
A comercios y venta al por menor
A exportación, venta a granel o uso industrial
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80
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 2: Pasterurizador M3 marca Farli
Especificaciones
• En Acero Inoxidable AISI 304. • Termostato digital para control de temperatura de trabajo. • Termostato digital para el control de la temperatura de enfriamiento. • Controlador de presión de filtrado digital. • Bomba a paletas controlada por variador de velocidad electrónico. • Calentamiento en intercambiador de calor eléctrico. • Enfriado por intercambiador de calor a agua. • Dos filtros en línea, uno de malla plisada de 80 micrones y el segundo de 5 micrones en tela no tejida de fibra poliéster. • Alimentación eléctrica AC 220/380v 50/60Hz. • Gabinete en Acero Inoxidable.
Nota: La imagen y las especificaciones fueron extraídas de la página Web del fabricante (https://farli.com/).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
81
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 3: Tabla comparativa de requisitos mínimos establecidos para miles según el CAA, la Resolución GMC N° 015/94, CODEX STAN 12:1981 e IHC
PARÁMETRO Humedad por refractometría
Cenizas
Azúcares reductores
Sacarosa aparente Acidez libre
Actividad de la diastasa
Hidroximetilfurfural (HMF) Dextrinas totales
CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
RESOLUCIÓN GMC Nº 015/94
Ca pítul o X
Incorpora da por Res ol uci ón MSyAS N° 003, 11.01.95
CODEX ALIMENTARIUS
CODEX STAN 12-1981
Máximo 18 g/100 g
Máximo 20 g/100 g
Máximo 20 g/100 g
A 550-600 °C
A 550-600 °C
Miel de flores: máx. 0,6 g/100 g
Miel de flores: máx. 0,6 g/100 g
Miel de mielada y mezcla de miel de Miel de mielada y mezcla de miel de No especifica
mielada y miel de flores: máx. 1,0 mielada y miel de flores: máx. 1,0
g/100 g
g/100 g
Calculados como azúcar invertido Miel de flores: mín. 65 g/100 g Miel de mielada y mezcla de miel de flores: mín. 60 g/100 g
Calculados como azúcar invertido Miel de flores: mín. 65 g/100 g Miel de mielada y mezcla de miel de flores: mín. 60 g/100 g
Calculados como la suma de glucosa y fructosa Miel de flores: mín. 60 g/100 g Miel de mielada y mezcla de miel de flores: mín. 45 g/100 g
Miel de flores: máx. 8 g/100 g
Miel de flores: máx. 5 g/100 g
Miel de flores: máx. 5 g/100 g
Miel de mielada y mezcla de miel de Miel de mielada y mezcla de miel de Miel de mielada y mezcla de miel de
mielada y miel de flores: máx. 10 mielada y miel de flores: máx. 10 mielada y miel de flores: máx. 10
g/100 g
g/100 g
g/100 g
Máximo 40 meq/kg
Máximo 40 meq/kg
Máximo 50 meq/kg
Mínimo 8 unidades en la escala de Gothe Miel con un contenido bajo de enzima natural, mínimo 3 unidades Gothe (siempre que el HMF sea < 15 mg/kg)
Mínimo 8 unidades en la escala de Gothe Miel con un contenido bajo de enzima natural, mínimo 3 unidades Gothe (siempre que el HMF sea < 15 mg/kg)
Mínimo 8 unidades en la escala de Schade Miel con un contenido bajo de enzima natural, mínimo 3 unidades Schade (siempre que el HMF sea < 15 mg/kg)
Máximo 40 mg/kg
Máximo 40 mg/kg
Máximo 40 mg/kg
Miel de flores: máx. 3 g/100 g
No especifica
No especifica
Conductividad eléctrica No especifica
No especifica
Miel de flores: máx. 0,8 mS/cm Miel de mielada: mín. 0,8 mS/cm
Sólidos insolubles en Máximo 0,1 g/100 g
Máximo 0,1 g/100 g
Máximo 0,1 g/100 g
agua
Miel prensada máx. hasta 0,5 g/100 g Miel prensada máx. hasta 0,5 g/100 g Miel prensada máx. hasta 0,5 g/100 g
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
82
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 4: Efecto en la actividad enzimática de los tratamientos térmicos aplicados en cada miel (M1, M2, M3 y M4)
A continuación, se detalla el efecto en la actividad enzimática de los tratamientos aplicados en cada miel. Las medias muestrales de NI del control y todas las medias de NI de las mieles con tratamiento fueron graficadas y se confeccionaron tablas en orden decreciente de NI en función de los resultados experimentales.
Para identificar diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos se realizó un Análisis de Varianza con un diseño completamente aleatorio y test LSD Fisher (Balzarini, y otros, 2012). Miel: M1
En la Figura 22 se puede observar que la muestra control, con una media de NI 13,8, fue la muestra con mayor actividad α-glucosidasa y las muestras sometidas a tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) tuvieron un valor medio de NI inferior respecto al control y esta diferencia fue estadísticamente significativa.
Tanto en las muestras tratadas a 60 °C como las tratadas a 70 °C se observó un descenso de la actividad enzimática cuanto mayor fue el tiempo de calentamiento. Las diferencias entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 min y 10 min, y 60 °C a 15 min y 20 min fueron estadísticamente significativas. No hubo diferencias significativas entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 min y 10 min. Las diferencias entre las medias de NI de las muestras tratadas a 70 °C por 1 min 30 s y 3 min no fueron estadísticamente significativos entre ellas. De igual modo las medias de NI de las muestras tratadas a 70 °C por 5 min y 10 min tampoco fueron estadísticamente significativos entre ellas. Finalmente, no hubo diferencias significativas de las medias de NI de las muestras tratadas a 70 °C por 15 min y 20 min. Esto se puede observar más claramente en la Tabla 18. Podemos decir que, los tratamientos a 60 °C por 20 min, 70 °C por 15 min y 70 °C por 20 min, con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min en la miel M1, implicaron una reducción de la actividad enzimática por debajo del valor recomendado internacionalmente (mínimo 10 NI) (Bogdanov S., et al., 1999) con una disminución de la actividad en un 32,4 %, 52,1 % y 50,7 % respectivamente.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
83
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
16 a) 13,8
a 14
12
10 NI
8
6
4
2
0
Control 60 °C
5 min 60 °C
10 min 60 °C
15 min 60 °C
20 min
12,5
12,4
b
b
11,4
c
Tratamiento
M1
9,4 d
16 b) 13,8
a 14
12
10,9 b; c
11,6 b 10,8 c
10,5 c
10
NI
6,6
8
d
M1
6,8 d
6
4
2
0
Control 70 °C
1
min
30
s
70
°C
3
min 70
°C
5
min 70
°C
10
min 70
°C
15
min 70
°C
20
min
Tratamiento
Figura 22: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M1.
a) Tratamientos a 60 °C. Análisis de varianza (R2=0,98 y CV=1.91) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. b) Tratamiento a 70 °C (R2=0,98 y CV=3,81) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. Las medias con una letra común no
son significativamente diferentes (p≤0,05).
Tabla 18: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de muestras con tratamientos térmicos para la miel M1.
Miel
Tratamiento Temperatura Tiempo
M1 Control (sin tratamiento)
M1
60 °C
5 min
M1
60 °C
10 min
M1
60 °C
15 min
M1
60 °C
20 min
Media NI
13,8 12,5 12,4 11,4 9,4
EE
Significancia Disminución de (p≤0,05) actividad (%)
0,2
a
0,0
0,2
b
9,4
0,1
b
10,1
0,1
c
17,6
0,1
d
32,2
Miel
Tratamiento
Temperatura Tiempo
Media NI
EE
Significancia Disminución de
(p≤0,05) actividad (%)
M1 Control (sin tratamiento)
13,8
0,2
a
0,0
M1
70 °C
3 min
11,6
0,2
b
16,3
M1
70 °C
1 min 30 s
10,9
0,2
b; c
21,0
M1
70 °C
5 min
10,8
0,2
c
21,7
M1
70 °C
10 min
10,5
0,2
c
23,8
M1
70 °C
20 min
6,8
0,3
d
50,7
M1
70 °C
15 min
6,6
0,3
d
52,1
Nota: Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Miel: M2
En la Figura 23 se puede observar que la muestra control (sin ningún tratamiento),
con una media de NI 11,6, fue la muestra con mayor actividad α-glucosidasa y las muestras
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
84
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
sometidas a tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio tuvieron un valor medio de NI inferior respecto al control y esta diferencia fue estadísticamente significativa.
Tanto en las muestras tratadas a 60 °C como en las tratadas a 70 °C se observó un descenso de la actividad enzimática cuanto mayor fue el tiempo de calentamiento. Las diferencias entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 min, 10 min y 15 min no fueron estadísticamente significativas, sin embargo, existieron diferencias significativas entre estas medias de NI y la media de NI de la muestra tratada a 60 °C por 20 min. Las diferencias de las medias de NI de las muestras tratadas a 70 °C fueron estadísticamente significativas con excepción de las tratadas a 70 °C por 15 min y 20 min. Podemos decir que, los tratamientos a 60 °C por 5, 10, 15 y 20 min; y los tratamientos a 70°C por 1 min 30 s, 3, 5, 10, 15 y 20 min, con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min en la miel M2, implicaron una reducción del NI por debajo del valor recomendado internacionalmente (mínimo 10 NI) (Bogdanov S., et al., 1999). La máxima disminución de la actividad fue del 36,2 % para el tratamiento térmico de 60 °C por 20 min, y 39,8 % y 40,1 % para los tratamientos térmicos a 70 °C por 15 y 20 min respectivamente. Esto se puede ver más claramente en la Tabla 19.
14
a) 11,6
12
a
10
8 NI
9,7 b
9,6 b
9,2 b
M2
7,4 c
14
b) 11,6
M2
a
12
10
8 NI
9,5 b
9,1 c
8,6
8,1
d
e
7,0 7,0
f
f
6
6
4
4
2
2
Control 60 °C
5 min 60 °C
10 min 60 °C
15 min 60 °C 20 min
0 Tratamiento
0
Control 70 °C
1
min
30
s
70
°C
3
min 70
°C
5
min 70
°C
10
min 70
°C
15
min 70
°C
20
min
Tratamiento
Figura 23: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M2.
a) Tratamientos a 60 °C. Análisis de varianza (R2=0,97 y CV=2,72) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. b) Tratamiento a 70 °C (R2=0,98 y CV=3,81) y test “a
posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. Las medias con una letra común no
son significativamente diferentes (p≤0,05).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
85
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Tabla 19: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de muestras con tratamientos térmicos para la miel M2.
Miel
Tratamiento Temperatura Tiempo
M2 Control (sin tratamiento)
M2
60 °C
5 min
M2
60 °C
10 min
M2
60 °C
15 min
M2
60 °C
20 min
Media NI
11,6 9,7 9,6 9,2 7,4
EE
Significancia Disminución de (p≤0,05) actividad (%)
0,2
a
0,0
0,2
b
17,0
0,2
b
18,0
0,2
b
21,0
0,2
c
36,2
Miel
Tratamiento
Temperatura Tiempo
Media NI
EE
Significancia Disminución de
(p≤0,05) actividad (%)
M2 Control (sin tratamiento) 11,6
0,1
a
0,0
M2
70 °C
1 min 30 s
9,5
0,1
b
18,1
M2
70 °C
3 min
9,1
0,1
c
22,0
M2
70 °C
5 min
8,6
0,1
d
26,5
M2
70 °C
10 min
8,1
0,1
e
30,8
M2
70 °C
15 min
7,0
0,2
f
39,8
M2
70 °C
20 min
7,0
0,2
f
40,1
Nota: Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Miel: M3
En la Figura 24 se puede observar que la muestra control (sin ningún tratamiento),
con una media de NI 15,9, fue la muestra con mayor actividad α-glucosidasa y las muestras
sometidas a tratamientos térmicos (combinación de temperatura y tiempo) simulados en
laboratorio produjeron una reducción estadísticamente significativa del NI respecto al
control.
Tanto en las muestras tratadas a 60 °C como en las tratadas a 70 °C se observó un
descenso de la actividad enzimática cuanto mayor fue el tiempo de calentamiento. Las
diferencias entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 min y 10 min no
fue estadísticamente significativas, de igual modo ocurrió con las muestras tratadas a 60°C
por 10 y 15 min. Si hubo diferencia significativa en las medias de NI de las muestras tratadas
a 60 °C por 20 min y estos dos grupos. Para las muestras tratadas a 70 °C no hubo
diferencias estadísticamente significativas entre las medias de NI a 1 min 30 s, 3, 5 y 10 min.
Tampoco hubo diferencias significativas entre las medias de NI de las muestras tratadas a
70 °C por 15 min y 20 min pero sí entre estos dos grupos. Podemos decir que, los
tratamientos a 60 °C por 20 min, con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min, implicó
una reducción por debajo del valor recomendado internacionalmente (mínimo 10 NI)
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
86
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
(Bogdanov S., et al., 1999), con una disminución del 40,1 % de la actividad. Esto no ocurrió para los tratamientos a 70 °C. Esto puede verse más claramente en la
Tabla 20.
18 a) 15,9
a
16
13,6
b
14
12
NI 10
13,0
b; c
11,7
c
M3
9,5 d
8
6
4
2
0
Control
5 min 60 °C
10 min 60 °C
15 min 60 °C
20 min 60 °C
Tratamiento
18 b) 15,9
M3
a
16
12,4 12,7 13,0 12,9
14
b
b
b
b
10,5 10,9
12
c
c
NI 10
8
6
4
2
0
min min
min min
15 20
5 10
70 °C 3 min
Control min 30 s °C
°C
°C °C
70
70 70
°C 1 70
70
Tratamiento
Figura 24: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M3.
a) Tratamientos a 60 °C. Análisis de varianza (R2=0,93 y CV=5,65) y test “a posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. b) Tratamiento a 70 °C (R2=0,96 y CV=3,42) y test “a
posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Tabla 20: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de muestras con tratamientos térmicos para la miel M3.
Miel
Tratamiento
Temperatura Tiempo
M3 Control (sin tratamiento)
M3
60 °C
5 min
M3
60 °C
10 min
M3
60 °C
15 min
M3
60 °C
20 min
Media NI
15,9 13,6 13,0 11,7 9,5
EE
Significancia Disminución de
(p≤0,05) actividad (%)
0,4
a
0,0
0,5
b
14,7
0,4
b; c
18,2
0,4
c
26,5
0,4
d
40,1
Miel
Tratamiento Temperatura Tiempo
Media NI
EE
Significancia Disminución de (p≤0,05) actividad (%)
M3 Control (sin tratamiento)
15,9
0,2
a
0,0
M3
70 °C
5 min
13,0
0,3
b
18,2
M3
70 °C
10 min
12,9
0,3
b
19,1
M3
70 °C
3 min
12,7
0,3
b
20,1
M3
70 °C
1 min 30 s
12,4
0,3
b
22,1
M3
70 °C
20 min
10,9
0,3
c
31,5
M3
70 °C
15 min
10,5
0,3
c
34,2
Nota: Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
87
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Miel: M4 En la Figura 25 se puede observar que la muestra control (sin ningún tratamiento)
con una media de NI 12,1, fue la muestra con mayor actividad α-glucosidasa y cualquier tratamiento térmico aplicado (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio produjeron una reducción estadísticamente significativa del NI respecto al control.
Tanto en las muestras tratadas a 60 °C como en las tratadas a 70 °C se observó un descenso de la actividad enzimática cuanto mayor fue el tiempo de calentamiento. Las diferencias entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 y 10 min fueron estadísticamente significativos. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 15 y 20 min, pero sí entre este grupo y las medias de NI de las muestras tratadas a 60 °C por 5 y 10 min. Las medias de NI para las muestras tratadas a 70 °C no mostraron diferencias significativas claras por lo que no se pueden tener conclusiones en base a los datos estadísticos. Podemos decir que, el tratamiento a 60 °C por 15 y 20 min, con un calentamiento previo a 50 °C por 30 min, implicó una reducción por debajo del valor recomendado internacionalmente (mínimo 10 NI) (Bogdanov S., et al., 1999), con una disminución del 21.9 % de la actividad. Esto puede verse más claramente en la Tabla 21.
NI NI
14 a) 12,1
a
11,3
12
b
10,4
c
9,3
10
d
M4
9,7 d
8
6
4
2
0
Control
5 min 60 °C
10 min 60 °C
15 min 60 °C
20 min 60 °C
Tratamiento
14 b) 12,1 a
12
10,4 b; c
10
10,9 b
9,3 d; e
9,9 c; d 8,9
e
M4
10,0 c; d
8
6
4
2
0
Control 70 °C
1
min
30
s
70
°C
3
min 70
°C
5
min 70
°C
10
min 70
°C
15
min 70
°C
20
min
Tratamiento
Figura 25: Gráfico de barra de NI para la muestra control y muestras con tratamiento térmico (combinación de temperatura y tiempo) simulados en laboratorio para la miel M4.
a) Tratamientos a 60 °C. Análisis de varianza (R2=0,96 y CV=2,67) y test “a posteriori” LSD de
Fisher aplicado a los datos experimentales. b) Tratamiento a 70 °C (R2=0,92 y CV=3,80) y test “a
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
88
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
posteriori” LSD de Fisher aplicado a los datos experimentales. Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Tabla 21: NI de muestra control y porcentaje de disminución de NI respecto al control de muestras con tratamientos térmicos para la miel M4.
Miel
Tratamiento
Temperatura Tiempo
M4 Control (sin tratamiento)
M4
60 °C
5 min
M4
60 °C
10 min
M4
60 °C
15 min
M4
60 °C
20 min
Media NI
12,1 11,3 10,4 9,7 9,3
EE
Significancia Disminución de
(p≤0,05) actividad (%)
0,1
a
0,0
0,2
b
6,8
0,2
c
14,7
0,2
d
20,5
0,2
d
23,2
Miel
Tratamiento Temperatura Tiempo
Media NI
EE
Significancia Disminución de (p≤0,05) actividad (%)
M4 Control (sin tratamiento) 12,1
0,2
a
0,0
M4
70 °C
5 min
10,9
0,2
b
10,3
M4
70 °C
1 min 30 s
10,4
0,2
b; c
14,3
M4
70 °C
20 min
10,0
0,3
c; d
17,7
M4
70 °C
10 min
9,9
0,2
c; d
18,7
M4
70 °C
3 min
9,3
0,2
d; e
23,1
M4
70 °C
15 min
8,9
0,3
e
27,1
Nota: Las medias con una letra común no son significativamente diferentes (p≤0,05).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
89
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 5: Efecto de la adulteración con jarabe mezcla en la actividad α-glucosidasa en cada miel (M1, M2, M3 y M4)
En este apéndice se detalla el efecto de la adulteración en la actividad α-glucosidasa en cada miel. La actividad fue expresada como actividad específica (µmol/min/mg de proteína).
Miel M1 La mayor actividad enzimática se produjo a 40 °C, confirmando que esta también es
la temperatura de mayor actividad de la α-glucosidasa como ya se vio con la enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae (punto 4.2.2). Por otro lado, la actividad decreció abruptamente a 50 °C y 60 °C donde la enzima comienza a desnaturalizarse como se vio con la enzima purificada (punto 4.2.2 y 4.2.3). La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada al 10 % P/P de jarabe y la misma dilución con agua destilada, no mostró diferencias estadísticamente significativas de las medias a 30, 40 y 50 °C. La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada al 20 % P/P con agua destilada, no mostró diferencias significativas de las medias, comportándose según lo esperado. Mientras que hubo diferencias significativas entre las medias de la muestra control y la mezcla con 20 % P/P de jarabe a 40 °C y a 50 °C. Si bien en ambas experiencias, se observaron diferencias significativas entre el control y las mezclas a 60 °C, no queda claro este comportamiento ya que solo se presentó en la miel M1, pudiendo deberse a problemas del método. Los resultados fueron graficados y se muestran en la Figura 26.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
90
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,12
M1
0,10
0,08
0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 10 % con jarabe mezcla
a
Miel adulterada 10 % con agua destilada
b c
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,12 a
0,10
a a
0,08 b a
0,06
b 0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
Temperatura (°C)
M1
a b b 60
Figura 26: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M1 a distintas temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 % P/P y 20 %
P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P= 0,050).
Miel M2 La mayor actividad enzimática se produjo a 40 °C, confirmando que esta también es
la temperatura de mayor actividad de la α-glucosidasa como ya se vio con la enzima purificada a partir de Saccharomyces cerevisiae (punto 4.2.2). Por otro lado, la actividad decreció abruptamente a 50 °C y 60 °C donde la enzima comienza a desnaturalizarse como se vio con la enzima purificada (punto 4.2.2 y 4.2.3). La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 10 % P/P de jarabe y la miel rebajada con 10 % P/P de agua destilada, no mostraron diferencias estadísticamente significativas de las medias a 30, 40 y 60 °C. Se observó diferencias significativas en las medias entre el control y las mezclas a 50 °C en ambos casos. La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 20 % P/P de agua destilada, solo mostró diferencias significativas de las medias a los 50 °C. Mientras que hubo diferencias significativas entre las medias de la muestra control y la mezcla con 20 % P/P de jarabe a 30 °C y a 50 °C. Los resultados fueron graficados y se muestran en la Figura 27.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
91
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,20
M2
0,15 a
0,10 b b
0,05
Miel sin adulterar (control)
Miel adulterada 10 % jarabe mezcla
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,20 a
a 0,15
b
0,10
M2
a b c
0,05
Miel sin adulterar (control)
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
Figura 27: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M2 a distintas temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 % P/P y 20 %
P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P= 0,050).
Miel M3 La mayor actividad enzimática se produjo a 40 °C, confirmando que esta también es
la temperatura de mayor actividad de la α-glucosidasa como ya se vio con la enzima purificada a partir de Saccharomices cerevisiae (punto 4.2.2). Por otro lado, la actividad decreció abruptamente a 50 °C y 60 °C donde la enzima comienza a desnaturalizarse como se vio con la enzima purificada (punto 4.2.2 y 4.2.3). La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 10 % P/P de jarabe y miel rebajada con 10 % P/P de agua destilada, no mostró diferencias estadísticamente significativas de la media a 30, 40, 50 y 60 °C. La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 20 % P/P de agua destilada, no mostró diferencias estadísticamente significativas de la media a 30, 40, 50 y 60 °C, comportándose según lo esperado. Sin embargo, hubo diferencias significativas entre las medias de la muestra control y la mezcla con 20 % P/P de jarabe a 30, 40 y 50 °C, y entre las medias de la mezcla con 20 % P/P de agua destilada y con la mezcla con 20 % P/P de jarabe a las mismas temperaturas. Los resultados fueron graficados y se muestran en la Figura 28.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
92
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,18
M3
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
Miel adulterada 10 % jarabe mezcla
0,02
Miel adulterada 10 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,18 a 0,16
a 0,14
0,12 b 0,10
a
M3
a
a
a b
0,08
b
0,06
0,04
Miel sin adulterar
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
0,02
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
Figura 28: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M3 a distintas temperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 % P/P y 20 %
P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P, y muestra control. Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que mostraron diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P= 0,050).
Miel M4 La mayor actividad enzimática se produjo a 40 °C, confirmando que esta también es
la temperatura de mayor actividad de la α-glucosidasa como ya se vio con la enzima purificada a partir de Saccharomices cerevisiae (punto 4.2.2). Por otro lado, la actividad decreció abruptamente a 50 °C y 60 °C donde la enzima comienza a desnaturalizarse como se vio con la enzima purificada (punto 4.2.2 y 4.2.3). La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 10 % P/P de agua, no mostró diferencias estadísticamente significativas de las medias a 30, 40, 50 y 60 °C comportándose según lo esperado. Se observó a 30 °C diferencias significativas de las medias entre la muestra control y la mezcla con 10 % P/P de jarabe. La comparación de la actividad específica de la muestra control y la miel rebajada con 20 % P/P de agua, no mostró diferencias estadísticamente significativas de las medias a 30, 40, 50 y 60 °C, comportándose según lo esperado. Sin embargo, hubo diferencias significativas entre las medias de la muestra control y la mezcla con 20 % P/P de jarabe a 30, 40 y 50 °C, y entre las medias de la mezcla con 20 % P/P de agua destilada y con 20 % P/P de jarabe a las mismas temperaturas. Los resultados fueron graficados y se muestran en la Figura 29.
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
93
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Actividad específica ( mol/min/mg prot.) Actividad específica ( mol/min/mg prot.)
0,14
M4
0,12 a a
0,10
b
0,08
0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 10 % jarabe mezcla
Miel adulterada 10 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
0,14
a
a
M4
0,12
a 0,10
a a
b
a
b
0,08
b 0,06
0,04
Miel sin adulterar (control)
0,02
Miel adulterada 20 % jarabe mezcla
Miel adulterada 20 % agua destilada
0,00
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (°C)
Figura 29: Gráfica de la actividad específica de α-glucosidasa de la miel M4 a distintastemperaturas (30, 40, 50 y 60 °C) para concentraciones de miel y jarabe mezcla de 10 %
P/P y 20 % P/P, de miel y agua destilada de 10 % P/P y 20 % P/P y muestra control. Letras diferente y del mismo color corresponden a las medias de actividad específica que mostraron
diferencias estadísticamente significativas tras aplicar el test de Student (P= 0,050).
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
94
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 6: Certificado de análisis del Jarabe Mezcla marca Sucrodex, de QUIMINSA
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
95
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Apéndice 7: Presentación del trabajo en el VII Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Córdoba, Argentina
Estudio de la actividad invertasa en mieles del Departamento de Cruz del Eje (Córdoba).
96
Tratamiento térmico y posible adulteración. (Mónica Federico)
Ver+/-
