Bioq. LARISA POZO
DESARROLLO DE FORMULACIONES TÓPICAS DE EXTRACTOS NATURALES PARA TRATAMIENTOS DE AFECCIONES EN PIEL DE ORIGEN INMUNO-INFLAMATORIO
Bs As | JUNIO| 2024 Directoras: Dra. María Victoria Defain Tesoriero y Dra Ana Paula Perez
ÍÍnndidce ice
• Introducción
• Histopatología de la piel con psoriasis • El Sistema Endocannabinoide en Piel • Los Fito-cannabinoides • Nanopartículas Lipídicas Nanoestructuradas
• Objetivo
• Metodologías y Resultados
• Hitos/Objetivos alcanzados
• Acciones a futuro
• Logros
• Bibliografía
poros
Piel: Epidermis Normal
glándula sudorípara
grasa
Adaptado de
pelo
glándula sebácea nervio vasos sanguíneos folículo piloso
Piel:
Estrato córneo
Epidermis Estrato granular HiNstoorlomgaíal Estrato espinoso
Estrato basal
Piel normal Queratinocitos
Piel con psoriasis
Melanocitos
Células T Macrófagos Mastocitos
Células dendríticas Células de Langerhans Vasos sanguíneos
Adaptado de Crow, J. 2012
IL-17A, IL17F, IL-22, IL-21, TNFα
Th1 (CD4) Th17
Predisposición genética
Algún agente disparador
Hiperproliferación de los queratinocitos
Infiltrado Inflamatorio
Diferenciación tardía
Parakeratosis Acantosis
INFγ TNFα IL-23 IL-12
Epidermis Dermis
DC- MO-T-Neu T
Desmet et al, 2017
• Respuesta Inmune exacerbada • Hiper-proliferación de queratinocitos • Aumento en la vascularización
Perfil Th1/Th2 Disminución de la expresión de PPARγ Hay ↑ en la expresión de K6/16
Psoriasis Tratamientos
Tópicos
Corticoides
Inmuno-moduladores
COSTO
Aproximadamente el 40% de los pacientes con psoriasis requiere fototerapia o terapias sistémicas
La fototerapia
Teratogenia, neoplasias malignas y hepatotoxicidad; mientras que las biomoléculas pueden generar reactivación de infecciones preexistentes, como hepatitis B
COMPLEJO COSTO
Las terapias sistémicas → Biológicas → Pequeñas moléculas
Inmunomoduladores
Cannabinoides CB1
Nuclear
CB2
Queratinocitos Melanocitos
Cél. Inmunes Inmunomodulación
Sistema Endocannabinoide
EN PIEL Namazi, 2005; Nagarkatti et al, 2009, Roelandt et al, 2012; Toht et al, 2011; Maccarone et al, 2003; Cassanova et al, 2003
Cél. sensitivas Cél. Vasos Capilares
•↑Diferenciación •↓Proliferación
•Proapoptótico •Modula liberación de citoquinas •Inducción rta T-reguladora •↓la pres de Ag
•Picazón •Dolor
•↓ vascularización •↓ angiogénesis
Inflorescencias
Fitocannabinoides
THC
CBD
Cannabis sativa
TetraHidroCannabinol y CannaBiDiol
Moléculas liposolubles Sensibles a la degradación por luz y a la oxidación
Nanopartícula Lipídica Nanoestructurada
Principio Activo
• Los fitocannabinoides se disuelven en los
lípidos.
• Su estructura los protege de la degradación.
• Su tamaño favorece su penetración.
• La combinación LL-LS estabiliza la formulación
evitando la expulsión de los principios activos.
Tensioactivo Lípido Sólido Lípido Líquido
Objetivo
Desarrollar nanopartículas lipídicas nanoestructuradas que preserven y protejan los fitocannabinoides incorporados en su estructura.
Objetivos específicos alcanzados a la fecha
01.
● ● ●
Obtención de extractos etanólicos
Extracción Secado Descarboxilación
02. Caracterización de los extractos
●
TLC
●
GC-MS
03.
● ●
Ensayos de pre-formulación
Compatibilidad Lípidos Selección de tensioactivos
04. Desarrollo de las NLN
●
Formulación
●
Caracterización: Tamaño de partícula y Estabilidad
Obtención del extracto
Flores secas
Extracción etanólica
Evaporación a 100º C Descarboxilación
EXTRACTOS RICOS EN CBD O THC
Caracterización de extracto
TLC con revelado de Mo
Calle T: Estándar de THC Calle CB: Estándar de CBD Calle I: Extracto quimiotipo II (mexcla de THC y CBD) Calle J: Extracto quimiotipo III (CBD) Calle K, L, M: Extracto quimiotipo I (THC)
Nanopartícula Lipídica Nanoestructurada
Principio Activo
Tensioactivo
Lípido Sólido
Lípido Líquido
• Compatibilidad Ext-LS A MENOR CANTIDAD DE LS AGREGADO, MAYOR COMPATIBILIDAD CON EL EXTRACTO • Compatibilidad Ext-LL A MAYOR CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO, MAYOR COMPATIBILIDAD CON EL LL
Ensayos de preformulación
THC
• Compatibilidad Ext-LS A MENOR CANTIDAD DE LS AGREGADO, MAYOR COMPATIBILIDAD CON EL EXTRACTO • Compatibilidad Ext-LL A MAYOR CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO, MAYOR COMPATIBILIDAD CON EL LL
Ensayos de preformulación
CBD
DETERMINACIÓN DEL HLB
Formulación NLN-THC
HLBr A x %A + HLBr B x % B = HLBr (A+B)
HLBrA: HLBr del lípido A HLBrB: HLBr del lípido B %A: porcentaje relativo en peso de lípido A en la mezcla A+B %B: porcentaje relativo en peso de lípido B en la mezcla A+B HLBr(A+B): HLBr de la mezcla A+B
Teórico : 14,2
Teórica
3 ciclos de
Congelado a -15ºC (1 h) Baño a 60ºC (15 min) Centrifugación a 2000 g (20 min)
Empírica
I = 15,7 II = 15,2 III = 14,7 IV = 14,2 V = 13,7
Nanopartícula Lipídica Nanoestructurada
Principio Activo
Tensioactivo
Lípido Sólido
Lípido Líquido
NLN1-CBD
Principio Activo
Tensioactivo
Lípido Sólido
Lípido Líquido
NLN2-THC
TAMAÑO (Z Average-nm) - ÍNDICE DE POLIDISPERSIÓN (PDI) – Potencial Z
Caracterización de las NLN
Nano Z Sizer, ZEN3600
NLN1-CBD +41,4 ± 2,35
Potencial Z (mV)
NLN1 +36,67 ± 0,35
NLN2-THC -27,87 ± 2,22
NLN2 -23,37 ± 1,40
ESTABILIDAD ACELERADA
Caracterización de las NLN
LUMiSizer®
Objetivos Alcanzados
● Se estandarizó un método de extracción con el cual se obtuvieron todos los
extractos utilizados.
● Se identificaron lípidos y tensioactivos con afinidad por THC y CBD. ● Se lograron obtener dos formulaciones de nanopartículas lipídicas
nanoestructuradas con 10% de extracto.
● Las nanoparticulas lipídicas nanoestructuradas fueron caracterizadas en
tamaño y potencial Z.
● Se determinó la estabilidad física de las nanoparticulas lipídicas
nanoestructuradas mediante el ensayo de estabilidad acelerada.
OT Para desarrollo de fórmula cosmética aprovechamiento de subproductos.
Bibliografía
● Crow, J. Psoriasis uncovered. Nature 492, S50–S51 (2012). https://doi.org/10.1038/492S50a ● Desmet E, Ramadhas A, Lambert J, Van Gele M. In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Exp Biol Med (Maywood). 2017 Jun;242(11):1158-1169. doi: 10.1177/1535370217710637. PMID: 28585891; PMCID: PMC5478008. ● Namazi (2005) Namazi MR. Cannabinoids, loratadine and allopurinol as novel additions to the antipsoriatic ammunition. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 2005;19:319–322. doi: 10.1111/j.1468-3083.2004.01184.x ● Nagarkatti P, Pandey R, Rieder SA, Hegde VL, Nagarkatti M. Cannabinoids as novel antiinflammatory drugs. Future Med Chem. 2009 Oct;1(7):1333-49. doi: 10.4155/fmc.09.93. PMID: 20191092; PMCID: PMC2828614. ● De Vita D, Madia VN, Tudino V, et al. Comparison of different methods for the extraction of cannabinoids from cannabis. Nat Prod Res. 2020;34(20):2952-2958. doi:10.1080/14786419.2019.1601194 ● Roelandt, T., Heughebaert, C., Bredif, S., Giddelo, C., Baudouin, C., Msika, P., Roseeuw,
D., Uchida, Y., Elias, P.M. and Hachem, J.-P. (2012), Cannabinoid receptors 1 and 2
oppositely regulate epidermal permeability barrier status and differentiation. Exp
Dermatol, 21: 688-693. https://doi.org/10.1111/j.1600-0625.2012.01561.x, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21924194 ● Balázs I. Tóth, Nóra Dobrosi, Angéla Dajnoki, Gabriella Czifra, Attila Oláh, Attila G. Szöllősi, István Juhász, Koji Sugawara, Ralf Paus, Tamás Bíró, Endocannabinoids Modulate Human Epidermal Keratinocyte Proliferation and Survival via the Sequential Engagement of Cannabinoid Receptor-1 and Transient Receptor Potential Vanilloid-1, Journal of Investigative Dermatology, Volume 131, Issue 5, 2011, Pages 1095-1104, ISSN 0022-202X, https://doi.org/10.1038/jid.2010.421.
● Maccarrone M, Di Rienzo M, Battista N, Gasperi V, Guerrieri P, Rossi A, Finazzi-Agrò A. The endocannabinoid system in human keratinocytes. Evidence that anandamide inhibits epidermal differentiation through CB1 receptor-dependent inhibition of protein kinase C, activation protein-1, and transglutaminase. J Biol Chem. 2003 Sep 5;278(36):33896-903. doi: 10.1074/jbc.M303994200. Epub 2003 Jun 18. PMID: 12815050. ● M. Llanos Casanova, Cristina Blázquez, Jesús Martínez-Palacio, Concepción Villanueva, M. Jesús Fernández-Aceñero, John W. Huffman, José L. Jorcano, Manuel Guzmán. Inhibition of skin tumor growth and angiogenesis in vivo by activation of cannabinoid receptors. J Clin Invest. 2003;111(1):43-50. https://doi.org/10.1172/JCI16116 ● Wang M, Wang YH, Avula B, et al. Decarboxylation Study of Acidic Cannabinoids: A Novel Approach Using Ultra-High-Performance Supercritical Fluid Chromatography/Photodiode ArrayMass Spectrometry. Cannabis Cannabinoid Res. 2016;1(1):262-271. doi:10.1089/can.2016.0020 ● Zaharia LS, Trofin I, Vaireanu DI, Dabija G. Influence of temperature and heating time on the decarboxylation of Δ9-thca and cbda in the cannabis inflorescences. UPB Sci Bull Ser B Chem Mater Sci. 2020;82(3):73-84. ● Joshi M, Patravale V. Formulation and evaluation of nanostructured lipid carrier (NLC)-based gel of valdecoxib. Drug Dev Ind Pharm. 2006;32(8):911-918. doi:10.1080/03639040600814676 ● Croda. The HLB System. Society. 2004;37(10):1390-1393. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21924194 ● Ohba N. Hydrophile-Lipophile Balance Values for O/W Emulsions Stabilized by Nonionic Surfactants. II. “Required Hydrophile-Lipophile Balance Values” of the Oil Mixture. Bull Chem Soc Jpn. 1962;35(6):1021-1025. doi:10.1246/bcsj.35.1021 ● Yamashita Y, Miyahara R, Sakamoto K. Emulsion and Emulsification Technology. Elsevier Inc.; 2017. doi:10.1016/B978-0-12-802005-0.00028-8 ● Americas I. The HLB System. Society. 1980;37(10):1390-1393.
MUCHAS GRACIAS
Próximos pasos
1.
PERMEACIÓN TRANSDÉRMICA Estudiar la permeación y penetración de las nano-
formulaciones en modelos in vitro y ex vivo de piel
sana y/o enferma
2.
ESTABILIDAD QUÍMICA Estudiar la actividad protectora de las nano-
formulaciones de fito-cannabinoides frente a
factores deteriorantes
3.
ENSAYOS EN CÉLULAS Determinar la citotoxicidad, la actividad anti-
proliferativa y la actividad antiinflamatoria de NLN-THC y
NLN-CBD, libres o incorporados en
las nanoformulaciones sobre cultivos de líneas celulares.
Ver+/-
