Salud
ASPARAGINASAS FÚNGICAS: ENZIMAS CON FUTURO
M.
Martínez
(1),
L.
Levin
(2),
P.
Babay
(3) ,
S.
Pereira
(2)
memartinez@inti.gob.ar
(1) Dto. de Ingredientes Activos y Biorrefinería-GODTEI-SOIyS – INTI. (2) Laboratorio de Micología Experimental-Dpto. de Biodiversidad y Biología Experimental- Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, InMiBo, CONICET. (3) Gerencia Química – CNEA
Palabras Clave: Asparaginasas, enzimas fúngicas, acrilamidas
INTRODUCCIÓN
La L-asparaginasa (E.C. 3.5.1.1: L-asparagina
amidohidrolasa) es una enzima que cataliza la
hidrólisis de L-asparagina en L-aspartato y
amonio. Además de su uso farmacológico
como anticancerígeno [1], tiene aplicación en la
industria alimenticia para reducir los niveles de
acrilamida en alimentos [2].
Fue descubierta a mediados de los ’50. Hoy se
emplea para el tratamiento de la leucemia
linfoblástica aguda (LLA), la leucemia
mieloblástica aguda (LMA) y otros tipos de
linfomas [3].
Por otra parte, su uso en la industria alimenticia
reduce los niveles de acrilamida en los
alimentos. Esta sustancia, genotóxica y
carcinogénica, se forma por la reacción de la
asparagina con los carbohidratos a
temperaturas superiores a 120°C durante la
elaboración de productos alimenticios como
panes, galletas, snacks, cereales, cacao, café,
etc.
Las L-asparaginasas que se utilizan en el
tratamiento de linfomas son de origen
bacteriano (Escherichia coli (EcA) y Erwinia
chrysanthemi (ErA)) y se utilizan en
combinación
con
otros
agentes
quimioterapéuticos. Estas enzimas son
efectivas, pero producen varias reacciones
adversas, ejemplo: hipofibrinogenemia,
hipoalbuminemia, hiperglicemia, hiperlipidemia,
pancreatitis aguda, eventos trombóticos y
reacciones alérgicas.
Debido a estos inconvenientes el mercado farmacéutico se encuentra en una constante búsqueda de nuevas fuentes de asparaginasas.
OBJETIVOS Explorar e identificar nuevas cepas fúngicas como fuentes alternativas para la producción de L-asparaginasa. Seleccionar las condiciones de cultivo que incrementen su producción.
Aislar, purificar y caracterizar a la enzima y finalmente escalar su producción.
DESARROLLO
De acuerdo a una búsqueda bibliográfica se seleccionaron cepas de distintas colecciones, entre ellas BAFCcult (FCEN-UBA) y algunas cepas comerciales y se evaluó su capacidad para producir esta enzima en medio agarizado.
Actividad asparaginasa en medio agarizado
Para la determinación de dicha capacidad se consideró la reacción de desaminación catalítica que produce la L-asparaginasa convirtiendo al aminoácido esencial asparagina en ácido aspártico y amoniaco, la detección (halo de hidrólisis azul en la placa verde por la alcalinización del medio) de algunos de los productos mencionados implican que existe actividad asparaginasa.
asparaginasas
asparagina
aspártico
Figura 1: esquema de la reacción de L-asparaginasas
Se evaluó la producción enzimática (37 cepas) en placas de Petri con medio agarizado Czapek-Dox modificado (compuesto por 2 g de glucosa, 10 g L-asparagina, 1,52 g KH2PO4, 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO4·7H2O, CuNO3·3H2O (trazas), ZnSO4·7H2O (trazas), FeSO4·7H2O (trazas), 20 g agar por litro de cultivo, pH inicial=6,2). También se empleó el medio GA [4], compuesto por 10 g de glucosa, 4 g de asparagina, medio basal: MgSO4·7H2O, HK2PO4, H2KPO4, solución de micro y
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macronutrientes, tiamina y biotina, 20 g de agar por litro de cultivo, pH inicial=6,2.
En ambos casos se agregó 0,009 % azul de bromotimol como indicador de pH (amarillo a pH ácido y azul pH alcalino). La actividad asparaginasa se detectó como un halo azul en la placa amarilla - verdosa (presencia de NH3) [5] (Fig. 2. A). Se determinó la velocidad de crecimiento midiendo el diámetro de colonia a distintos tiempos.
Figura 2: descripción del medio de cultivo sólido. A. Presencia de asparaginasas. Detección de una cepa productora de L- asparaginasa: placa inoculada con una cepa de Aspergillus sp. 2-LET-A-153 en medio agarizado Czapek-Dox modificado, suplementado con 0,009% azul de bromotimol (BTB). B. Ausencia de asparaginasas. Lentinus tigrinus BAFC 197 en medio agarizado Czapek-Dox modificado, suplementado con 0,009% azul de bromotimol (BTB). La ausencia de color azul evidencia la falta de actividad asparaginasa.
Actividad asparaginasa en medio líquido:
Las distintas cepas fúngicas fueron también
cultivadas en medio Czapek-Dox líquido con el
objetivo de corroborar su capacidad para
producir asparaginasa. Se incubaron en
condiciones estáticas a 28°C durante 15 días y
luego el sobrenadante de cultivo se separó por
filtración y se utilizó como fuente de enzima.
Para evidenciar la actividad asparaginasa se
empleará un reactivo que detecta el producto
de la reacción enzimática (NH4OH) mediante la
reacción de Berthelot [6]. El amoniaco
producido reacciona con el hipoclorito de sodio
y el fenol para producir el indofenol de color
azul,
el
cual
se
valora
espectrofotométricamente. Alternativamente se
empleará electroforesis capilar para determinar
los productos de la reacción.
RESULTADOS
En la revisión bibliográfica realizada se verificó que distintas especies fúngicas son capaces de producir asparaginasas, pertenecientes a las divisiones Ascomycota (ej. Aspergillus, Cladosporium y Penicillium) y Basidiomycota (Ganoderma lucidum y Flammulina velutipes: ambas productoras de basidiocarpos
comestibles y polisacáridos con diversas propiedades medicinales).
Tomando como base la información bibliográfica se seleccionaron y probaron 37 cepas fúngicas de Asco y Basidiomycota, para la detección de la actividad asparaginasa. quince de estas cepas dieron resultados positivos en el ensayo en medio agarizado y los 22 restantes no evidenciaron actividad (Fig. 2. B). Estos resultados serán corroborados en los ensayos en medio líquido.
CONCLUSIONES En base al relevamiento realizado se pudieron identificar distintas cepas fúngicas con capacidad para producir asparaginasa. En una etapa posterior se propone identificar a los más activos productores de dicha enzima (cepas que produzcan mayor actividad enzimática), optimizar las condiciones de cultivo para incrementar los títulos secretados y caracterizar y purificar la enzima.
Por último, cabe destacar que este proyecto es de interés institucional y contribuye al desarrollo tecnológico, a la promoción de la innovación y a la sustitución de importaciones, dado que esta enzima no se produce ni en Argentina ni en América Latina.
Índice TRL:3
AGRADECIMIENTOS El presente trabajo es parte de una tesis doctoral presentada en el Dpto. de Biodiversidad y Biología Experimental (DBBE) -FCEyN.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Salzer, et al., “Erwinia asparaginase achieves therapeutic activity after aspargase allergy: a report from the Children’s Oncology Group”. Blood, J Am Soc Hematol. (122), 2013, 507-514. [2] Ray; et al. “Isolation and characterization of microbial asparaginase to mitigate acrylamide formation in food”. Adv Plant Microb Biotechnol. 2019,95-100. [3] Castro et al., “L-asparaginase production review: bioprocess design and biochemical characteristics”, Applied Microbiology and Biotechnology, 105(11), junio 2021, 4515-4534. [4] Levin et al., “Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametestrogii. Mycologia”, 94(3), 2002, 377-383. [5] Gulati et al.”A rapid plate assay for screening l‐ asparaginase producing micro‐organisms”. Letters in applied microbiology, 24(1), 1997, 23-26. [6] Park et al, “Improvement of the ammonia analysis by the phenate method in water and wastewater’’. Bulletin of the Korean Chemical Society, 30(9), 2009, 2032-2038.
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