Protocolo de análisis para el estudio de preparados enzimáticos con actividad proteolítica
Desprendimiento de actividades de I&D hacia servicios técnicos calificados
Cantera, C.(i); Goya, L.(i); Garro, M. L.(ii); López, L. M.(iii)
(i) Centro de Investigación y Desarrollo del Cuero (CITEC) (ii) Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CICPBA) (iii) Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales, Universidad Nacional de La
Plata (LIPROVE)
INTRODUCCION
Para asistir el desarrollo del proyecto “Depilado conservador del pelo libre de sulfuros. Empleo de preparados enzimáticos como agentes depilantes”, cuyo objetivo rector es lograr una tecnología que permita conservar el pelo; producir cueros de la calidad requerida por los mercados; no utilizar sulfuro de sodio y reducir la carga orgánica del efluente líquido, el CITEC ha desarrollado un protocolo de análisis para la caracterización de las enzimas proteolíticas utilizadas en la industria del cuero.
El conocimiento de las propiedades de productos enzimáticos es relevante para mejorar la selección de los mismos, lograr un adecuado control en sus aplicaciones tecnológicas, así como para facilitar el diseño de un apropiado proceso de depilado de pieles.
La necesidad de conocer la acción que tienen las enzimas sobre diferentes proteínas de la piel animal condujo al empleo de substratos cromogénicos específicos derivados de componentes proteicos de la misma, para generar de este modo información que pueda ser correlacionada con las condiciones reales de los procesos.
OBJETIVO
Desarrollar un protocolo analítico para caracterizar, comparar y seleccionar preparados enzimáticos con actividad preteolítica, que permita además correlacionar la información de laboratorio con el comportamiento de los mismos sobre la piel en las distintas etapas de su elaboración.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Las técnicas utilizadas en el desarrollo del protocolo son las que se emplean habitualmente en la biología tradicional, las cuales se indican a continuación en la descripción del conjunto de procedimientos que conforman el protocolo:
Determinación del contenido de proteínas totales
Evaluación de la actividad proteolítica frente a los sustratos azul de polvo de piel, azocaseína, rojo de elastina, azul de queratina, azoalbúmina, tejido de epidermis y polvo de piel (evaluación de proteoglicanes)
Variación de la actividad en función del pH para cada uno de los sustratos
Perfil proteico. Electroforesis en SDS / gel de poliacrilamida (PAGE)
Isoelectroenfoque (IEF) y zimograma (evaluación de la actividad proteolítica)
Estudio de inhibición/activación de la actividad proteolítica utilizando componentes de las formulaciones de remojo y depilado.
Es de destacar la incorporación del denominado “sustrato epidermis”, el cual aporta el pelo, sus vainas y la epidermis; sustrato que permite lograr información sobre una etapa relevante de un depilado enzimático, ésta es: vulnerar la barrera que ofrece el tejido de epidermis. Asimismo, los estudios de la influencia de componentes utilizados en el remojo y depilado sobre la actividad proteolítica, empleando los ensayos del protocolo, aportan datos de interés sobre
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los efectos de activación-inhibición de las enzimas.
Esta información puede emplearse tanto para incentivar la actividad proteolítica o bien evitar o minimizar el deterioro de la estructura colagénica durante el transcurso de un proceso.
RESULTADOS
Atendiendo al espacio disponible en el resumen del trabajo, sólo se exhibe la información obtenida frente a los diferentes sustratos proteicos con dos preparados enzimáticos comerciales: Pellvit (Together For Leather TFL-), empleado en el proceso de remojo y Alcamax (Cergen s.a.) 1 utilizado en el proceso de depilado; y un extracto crudo de origen vegetal (no comercial) obtenido de frutos maduros de Maclura pomifera (Raf.) Schneid, cuya actividad es debida a un conjunto de proteasas (extracto vegetal) 2, datos que se compilan en la tabla I.
CONSIDERACIONES FINALES
El protocolo desarrollado por el CITEC permite adquirir relevantes conocimientos sobre preparados enzimáticos para orientar la selección de los mismos atendiendo a objetivos específicos. Especialmente en el proceso de depilación brinda información analítica para correlacionar las actividades proteotíticas con la actividad depilatoria de las enzimas empleadas.
La potencialidad del conjunto de los procedimientos que conforman el protocolo motivó la incorporación del mismo a la oferta de servicios calificados del instituto.
Tabla I: Actividad proteolítica de los preparados enzimáticos frente a los diferentes sustratos
Proteínas totales mg/g (ml)
Rojo de elastina unidades U E / g unidades UE / mg
Alcamax (Cergen
s.a.) (sólido)
47,5
2.375 50
Pellvit (TFL) (sólido)
2,3
180 79
Hide Power Azure
unidades UHPA / g
1.700
92
unidades uHPA/ mg
36
40
Azocaseína
unidades U Cas / g
1.100
32
Unidades UCas/ mg
24
14
Albúmina bovina
unidades U Alb / g
4.370
67
unidadesUAlb/ mg
92
29
“epidermis” pH11,5pH 12,5 pH 9 pH 11,5
unidades UEpi /g 570 520 12
13
unidadesUEpi/ mg 12 11 5
6
KA
unidades U KA / g
1.900
38
unidades UKA/mg
40
16
Polvo de piel
unidades U GAGs / g
520
7
unidadesUGAGs/ mg
11
3
‘Enzima vegetal’ (líquido)
1
sin actividad en
las condiciones del ensayo
8 8
6 6
12
12
pH8,4pH 10,8
3
3
3
3
1 1
1 1
1 UE = 0,1 Abs595 / h ; 1 UHPA = 0,1 Abs595 /min ; 1 UCas = 0,1 Abs440 /min ; 1 UAlb = 0,01 Abs280 /min 1U epi = 0,01 Abs280 / min ; 1 UKA = 0,1Abs595 / h ; 1 UGAGs = 1µg chondroitin sulfato/min.
Para mayor información contactarse con: Carlos Cantera – ccitec@infovia.com.ar
1 La elección de los productos comerciales no está vin-
culada a ninguna predilección por parte del instituto. 2 La preparación del extracto crudo se realizó siguiendo
el trabajo de Tesis “Aislamiento, purificación y caracterización de las proteasas presentes en el látex de frutos de Maclura pomifera (Raf.) Schneid” de la Dra Laura María Isabel López, en el Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales (LIPROVE), Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de La Plata.
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