EXPRESIÓN DE QUIMOSINA DE CAMELLO RECOMBINANTE.
M. B. Pirolai, Y. Nosedai, M. M. Adjadii, R. Zandomeniiii, A. Amadioii
iInstituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI) Lácteos Rafaela. iiInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Rafaela,
iiiInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. bpirola@inti.gob.ar
OBJETIVO El objetivo general de este trabajo es obtener un sistema de producción de quimosina recombinante que permita ensayar y cuantificar su actividad, con miras futuras de realizar un mejoramiento en la actividad de la misma mediante técnicas de biología molecular. El objetivo específico del presente trabajo es expresar en forma soluble y activa quimosina de camello recombinante.
DESCRIPCIÓN La quimosina es una enzima proteolítica de peso molecular de 35 kDa aproximadamente que se utiliza en la elaboración de quesos ya que las micelas de caseína pueden coagular por acción de la misma. La quimosina se ha obtenido originariamente del abomaso de terneros jóvenes. En los últimos años, la biotecnología ha posibilitado su reemplazo por variantes recombinantes de la misma, es decir, se ha clonado el gen de la quimosina en microorganismos y éstos se han utilizado para su producción (Kappeler 2006, Jacob 2010). El gen utilizado es el de la quimosina de camello, la cual ha mostrado una mejor performance de formación de cuajo, con una proteólisis menor (Tabla 1).
Tabla 1: Comparación entre diferentes quimosinas en
cuanto a la actividad de coagulación y actividad proteolítica
en función de la quimosina bovina.
Actividad de
Actividad
coagulación de la
proteolítica no
leche (% de
específica (% de
quimosina bovina) quimosina bovina)
Quimosina bovina
100
100
Quimosina de camello
170
25
Quimosina porcina
25
12
Fuente: Budtz 2011.
Para contar con la secuencia genética completa, el gen de quimosina de camello se sintetizó por completo y se clonó en el sistema de expresión pJexpress404 es cual es un sistema inducible por isopropil-β-D-1tiogalactopiranósido (IPTG). Para mejorar la expresión en E. coli, se realizó una optimización del uso de codones, es decir, se modificó la secuencia de ácido
desoxirribonucleico (ADN) para que codifique la misma proteína, pero usa codones que son más frecuentes en E. coli. A su vez, se le agregó un tag de histidinas para posibilitar su purificación por cromatografía de afinidad. El sistema de expresión correspondiente a E. coli permite la expresión de la enzima recombinante en grandes cantidades, pero esta sobreexpresión conlleva a la formación de cuerpos de inclusión que contienen casi exclusivamente la enzima recombinante. La proteína recombinante se expresó mediante la inducción de cultivos de la bacteria transformada en medio de cultivo Luria Bertani (LB) mediante el agregado de IPTG e incubando durante 4 y 24 horas a 37 ºC (Zhang, 1991). Luego de la inducción de la expresión se cosecharon las células por centrifugación a 5000 rpm, 4 ºC durante 15 min. Al pellet celular se lo resuspendió en buffer 50 mMTris/HCl, 30 mM NaCl. Las células se lisaron en sonicador mediante 5 pulsos de 30 s de ultrasonido a potencia 5. Luego se centrifugó nuevamente separando de esta manera la fracción soluble de la insoluble (Wingfield, 1995). Se analizó la expresión y pureza de la proteína mediantes electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (PAGE- SDS) al 12%. Se evaluó el poder coagulante según norma ISO – FIL 157A-2007, corroborando así que la enzima tiene o no actividad coagulante (si se expresa y procesa en forma activa).
RESULTADOS En cultivos inducidos durante 24 h se observaron cantidades importantes de quimosina recombinante. Análisis posteriores mostraron que el alto nivel de expresión resultó en la formación de cuerpos de inclusión, los cuales contienen casi exclusivamente la proteína recombinante (Figura 1).
1 2M P
116.0
66.2
45.0 35.0 25.0
18.4 14.4 Figura 1: PAGE-SDS 12%. Calle 1: fracción solule luego de lisis celular. Calle 2: Fracción insoluble luego de lisis celular. M: marcadores de peso molecular Thermo. P: Peso Molecular.
Sobre los cuerpos de inclusión se ensayaron diferentes metodologías de redisolución, como el agregado de urea y posterior diálisis (Figura 2). También se ensayaron metodologías de lavado y purificación de cuerpos de inclusión utilizando PMSF, Tritón X-100 y N-Lauril sarkosina (Narciandi 1991) (Figura 3).
1
2MP
170 130
100 70 55
40
35
25 15 10
Figura 2: PAGE-SDS 12%. Calle 1: fracción insoluble luego de lisis celular. Calle 2: fracción soluble luego de tratamiento con urea y diálisis. M: marcadores de peso molecular marca . P: Peso Molecular.
1
23
4 5M
P
170 130 100 70 55 40 35
25 15
10
Figura 3: PAGE-SDS 12%. Calle 1: refencia quimosina de camello. Calle 2: fracción soluble luego de lisis celular. Calle 3: fracción soluble luego de lavado de cuerpos de inclusión. Calle 4: solubilización de cuerpos de inclusión. Calle 5: fracción insoluble luego de solubilización de cuerpos de inclusión. M: marcadores de peso molecular marca. P: Peso Molecular.
Las fracciones solubles obtenidas luego de estos tratamientos resultaron no ser activas.
En cuanto a las muestras inducidas durante 4 horas la expresión fue mucho menor que a 24 h (no mostrado). Sin embargo, sobre las extractos solubles luego de la lisis celular por ultrasonido se realizaron ensayos de actividad coagulante y se observó poder coagulante sobre una de las fracciones. Esto puede deberse a la presencia de enzima soluble que no forma cuerpos de inclusión luego de dicho tiempo inducción dado que no se presenta sobreexpresión.
CONCLUSIONES No ha sido posible expresar en forma soluble y activa quimosina de camello recombinante luego de 24 horas de inducción. Actualmente se están realizando ensayos para maximizar la obtención de proteína en forma soluble y activa modificando los tiempos de inducción, la temperatura y las concentraciones de IPTG.
BIBLIOGRAFIA
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Brink, J., Kappeler, S., Farah Z. (2011). Método
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misma.
Patente
Internacional.
http://patentados.com/patente/metodo-
produccion-quimosina-no-bovina-uso-misma/
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Kappeler, S.R., Van den Brink, H.(J.)M.,
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Characterization of recombinant camel
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Biochemical and Biophysical Research
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Mohanty, A.K., Mukhopadhyay, U.K., Grover,
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Narciandi, R.E, Quiñones, Y., Morales, J.,
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Wingfield, P.T., Palmer, I. & Liang, S. (1995).
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Zhang, Y., Zhou, W., Liu, N., Yang, K. (1991).
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