Biotransformación fúngica del pelo vacuno: correlación entre los cambios estructurales y la acción enzimática
Galarza, B.C. (1); Garro, M.L.(1); Cavello, I.(1); Hours, R (2); Cantera, C.S.(1)
819 INTI-Cueros-CIC (2)CCINDEFI-CONICET
Introducción El depilado conservador del pelo, en sus diferentes modalidades, genera un nuevo desecho sólido en el sector de ribera: “el residuo pelo”. El cambio en la tecnología de depilado trasladó el problema de la elevada carga orgánica y sólidos suspendidos del efluente líquido de la ribera a un problema de disposición del residuo pelo, claro está, “el problema se ha concentrado”.
La generación diaria de una cantidad considerable del “residuo pelo” (del orden de 2,5 toneladas por cada 1000 pieles vacunas saladas procesadas) y la posibilidad de que este residuo, por sus propiedades físicas y químicas, pueda considerarse como una materia prima es que resulta atractivo desplegar esfuerzos de investigación y desarrollo para aportar alternativas tecnológicas que faciliten su valorización.
La composición del “residuo pelo”, producido en un proceso de depilado conservador, puede encontrarse dentro de los siguientes rangos: sólidos totales: 25-30%, nitrógeno total:1115%, Ca++ 2-3%, Na+ 1-2%, S 3-5% (% referidos a muestra libre de humedad), sulfuros 80-100 mg H2S/kg de pelo húmedo, filtrado y escurrido, humedad del 75%)1.
El mayor componente orgánico presente en el pelo es la proteína fibrosa queratina de una gran resistencia a los distintos tipos de hidrólisis. La formación de puentes disulfuro entre residuos del aminoácido cisteína adyacentes de distintas cadenas proteicas son los responsables de su gran estabilidad química.
Entre las distintas alternativas de valorización del residuo pelo se encuentra su degradación biológica a través de una biotransformación fúngica. El residuo pelo es el sustrato sólido sobre el cual crecen los hongos lográndose una mayor biodisponibilidad para una posterior utilización, por ejemplo en tecnología agropecuaria. La biotransformación fúngica tiene
el atractivo del ‘concepto de retroalimentación’, ya que en el proceso de biodegradación se generan un conjunto de proteasas que dan lugar a un extracto enzimático con potenciales aplicaciones en tecnología del cuero. Los objetivos de este trabajo son:1)evaluar, mediante microscopía electrónica de barrido, los cambios estructurales producidos por el cultivo del hongo Trichophyton ajelloi sobre el “residuo pelo” vacuno y correlacionarlos con la actividad proteolítica del extracto fúngico frente a sustratos de origen proteico queratínico y no queratínico, el contenido proteico y biomasa fúngica del cultivo sobre sustrato sólido; 2) comparar las actividades proteolíticas del extracto fúngico con aquellas correspondientes a preparados enzimáticos comerciales, habitualmente utilizados en tecnología del cuero.
Descripción Experimental 1.- Aislamiento de hongos con actividad queratinolítica
En el Reino Fungi existen numerosas especies reportadas como queratinofílicas o queratinolíticas, de acuerdo al grado de desorganización que producen en la estructura de la queratina. Dentro de estos últimos, encontramos a los géneros Trichophyton(2-7) Microsporum 8 y Epidermophyton, comúnmente llamados “dermatofitos”.
Entre los primeros podemos mencionar a especies medioambientales tales como Chrisosporium sp9,10, Fusarium sp, Aspergillus sp11, Doratomyces sp12,, Scopulariopsis sp13, de las cuales se han podido purificar las enzimas responsables de la degradación de la queratina y cuyo hábitat principal es el suelo.
La técnica de aislamiento de las especies fúngicas queratinolíticas utilizada en el presente estudio fue el “método del anzuelo” o “hair baiting” descripta por Vanbreuseghem14
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La cepa elegida para este estudio, Trichophyton ajelloi, fue aislada del suelo del corral de bóvidos del zoológico de la ciudad de la Plata y conservada en Agar Sabouraud adicionado con cloranfenicol para impedir el crecimiento bacteriano y cicloheximida para evitar el crecimiento de hongos medioambientales.
Esta especie no ha sido reportada como patógena para el ser humano o para los animales.
2.- Condiciones del cultivo
Se inocularon placas de Petri conteniendo 5 g de residuo pelo, autoclavado y molido con 10 ml de una suspensión de conidias del hongo, cuyo recuento promedio de viables en placa fue de 104 ufc/ml en un medio mineral mínimo con sales de NaH2PO4, K2HPO4), Cl3Fe, Cl2Zn y Cl2Ca (estos tres últimos en cantidades traza), pH: 7,4. La incubación se realizó a 28ºC en estufa con atmósfera húmeda durante 21 días.
3.- Preparación de la muestra para Microscopía Electrónica de Barrido
Luego del período de incubación del cultivo sobre residuo pelo desengrasado en Soxhlet con diclorometano durante 40 ciclos, se obtuvieron las muestras para su procesamiento en Microscopio Electrónico a partir de aquellas placas que mostraban un crecimiento fúngico macroscópico. Se procedió a la fijación de la muestra con formaldehído al 5%, previa hidratación y deshidratación con concentraciones crecientes de alcohol etílico. Luego se determinó el punto crítico de la muestra para poder ser observado con el Scanning Microscope (Jeol 6360 LV) perteneciente al Museo de Ciencias Naturales de La Plata. Este paso fue necesario debido a las distintas características químicas y físicas del micelio fúngico y del “residuo pelo” a analizar.
4.- Extracción enzimática
Se realizó la obtención del extracto crudo enzimático luego de los 21 días de cultivo, mediante el agregado de 30 ml de NaCl 0,5N a 5g del cultivo en placa mediante agitación suave durante 15 min. Los sólidos se separaron por filtración a través de membrana (tamaño de poro: 45 µm) y al líquido obtenido se le midió volumen y pH. Los extractos obtenidos a partir de las distintas placas se homogeneizaron, se fraccionaron y se congelaron a -20ºC hasta su utilización.
5.- Determinación de la actividad proteolítica y contenido proteico de los extractos crudos
Las distintas relaciones enzima/sustrato y tiempo de incubación fueron fijadas a fin de obtener una relación lineal, donde la enzima mantiene sus condiciones de actividad máxima y la absorbancia no sobrepase el valor de 0,315.
El sustrato de origen proteico no queratínico utilizado fue azocaseína (sulfanilamidaazocaseína) de Sigma Chem. Co. St. Louis, MO.
Se define la unidad de “actividad azocaseinolítica: Uazo” como la cantidad de enzima que en las condiciones del ensayo, produce un cambio de 0,1 unidad de Abs 440 por minuto y por mg de proteína.
Como sustratos de origen proteico queratínico se utilizaron “epidermis vacuna” y “residuo pelo”. El primero de ellos fue obtenido siguiendo el procedimiento indicado por Buechler y Lollar16 .
Se define la unidad de “actividad epidérmica: Uepi” como la cantidad de enzima que, en las condiciones del ensayo, produce un cambio de 0,01 unidad de Abs 280 por minuto y por mg de proteína.
Se define la unidad de “actividad queratinolítica: Uk“ como la cantidad de enzima que, en las condiciones del ensayo, produce un cambio de 0,01 unidad de Abs 280 por minuto y por mg de proteína17.
La concentración proteica fue medida por el Método de Bradford18.
6.- Determinación de biomasa fúngica en el cultivo
Como la pared del hongo está compuesta principalmente por quitina, un polímero de la Nacetilglucosamina, la medida de crecimiento fúngico se puede estimar mediante hidrólisis con KOH concentrado y posterior reacción colorimétrica con el reactivo MBTH (cloruro de 3metil-2-benzotiazolhidrazona) de la glucosamina liberada19. Se midió el contenido de glucosamina a partir del cultivo sobre “residuo pelo” después de 21 días de incubación a 28ºC en estufa en atmósfera húmeda y fue expresado como “µg de glucosamina por gramo de peso seco inicial de cultivo”.
Resultados y discusión
En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos con respecto a actividad enzimática del extracto sobre diferentes sustratos, su
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concentración proteica y la cantidad final de biomasa del cultivo.
Sustrato azocaseína ( Uazo/mg proteína)
Sustrato epidermis ( Uepi/mg proteína)
Sustrato residuo pelo (Uk/mg proteína
Biomasa (µg glucosamina/g peso seco)
Concentración proteica (mg/ ml)
1,1 24,6 20,0 6,81 0,185
Tabla 1: Caracterización del cultivo de T. ajelloi sobre sustrato sólido.
Las enzimas proteolíticas manifiestan su actividad sobre varios sustratos proteicos queratínicos y no queratínicos, mostrando una especificidad de amplio rango.
Observación de la muestra mediante Microscopía Electrónica de Barrido
En las siguientes cuatro fotografías se muestran las características del pelo nativo, luego de un proceso de depilado y al cabo del período de incubación con la especie fúngica.
Foto 1
Foto 2
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Foto 3
Foto 4
En un pelo vacuno nativo se puede observar la integridad de su cutícula dispuesta en tejuelas superpuestas (ver foto 1)
En el caso del “residuo pelo” luego de un depilado conservador conformado por un agente depilante orgánico, sulfuro de sodio y cal, se puede observar que la superficie se encuentra dañada, pero el pelo mantiene su integridad de fibra(ver foto 2)
En la Fotografía 3 la desorganización de la fibra se hace evidente debida al ataque fúngico producido durante el tiempo de cultivo con Trichophyton ajelloi, se puede apreciar la desorganización de la fibra donde los extremos hifales del micelio penetran entre las tejuelas cuticulares como “órganos perforadores“, arrancándolas desde su nacimiento (ver foto 3). Cuando se observa con mayor perspectiva la acción del hongo sobre la fibra, el micelio la rodea, destruyendo sus capas más externas y desprendiendo las tejuelas de la cutícula desde su raíz. Del análisis crítico de los resultados logrados se puede inferir que la liberación de las enzimas y su acción degradadora del pelo se produce en forma simultánea con la penetración mecánica del micelio. De esta manera, el hongo genera biomasa a expensas de los productos de degradación de la queratina que el micelio naciente va encontrando a su paso. Con relación a la actividad enzimática del extracto fúngico, cuando se comparan datos
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promedios correspondientes a preparados enzimáticos comerciales frente a un sustrato ‘proteico’, normalmente utilizado para medir actividad proteolítica (caseína, en nuestro caso azocaseína) y uno conformado por la epidermis, pelo y sus vainas (“sustrato epidermis”17) se pone en evidencia que el extracto fúngico expresa una mayor actividad ante el sustrato de origen queratínico (ver Tabla 2). Estos datos preliminares, al igual que los encontrados en los estudios publicados en la parte I de la serie “Biotransformación fúngica del pelo vacuno. Aislamiento de hongos con actividad queratinolítica” 20, con motivo del análisis de distintas relaciones de actividades con sustratos de origen colágeno, elastina y queratina, sugieren que las enzimas del extracto fúngico podrían ser utilizadas en el proceso de rendido, así como en el depilado.
preparado comercial 1(**)
preparado comercial 2 (***)
extracto fúngico
Sustrato 24,0
14,0
1,1
azocaseína
(Uazo/mg
proteína)
Sustrato 11,5
5,0
epidermis
(Uepi/mg proteína)
24,6
Tabla 2: Comparación de la actividad proteolítica del extracto fúngico y de preparados comerciales
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Referencias sobre los productos
* tensioactivo aniónico: ISOGRAS AN ** preparado comercial: Alcamax *** preparado comercial: Pellvit
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