Purificación de bacteriocinas producidas por lactobacillus curvatus CRL705 para su uso en envases de productos cárnicos
Blanco Massani, M.(i); Epifane, M.E.(i)
(i)INTI-Plásticos - CERELA-CONICET (ii)INTI-Carnes
Introducción
Las bacteriocinas son sustancias antimicrobianas producidas por numerosas especies de bacterias lácticas con capacidad inhibitoria frente a microorganismos contaminantes y patógenos de alimentos incluyendo Clostridium perfringes, Staphylococcus aureus, Brochothrix thermosphacta. y Listeria monocytogenes. Estos metabolitos naturales usados como una barrera adicional en la biopreservación de productos cárnicos podrían reemplazar la adición de antimicrobianos como los ácidos orgánicos y sus sales.
Las bacteriocinas son péptidos catiónicos, hidrofóbicos y difieren ampliamente en características tales como peso molecular, presencia de ciertos amino ácidos (aa), punto isoeléctrico (pI) y modificaciones posttraslacionales de algunos aa.
Esta heterogeneidad dentro de las bacteriocinas justifica los diferentes procesos desarrollados para su purificación, los que incluyen la precipitación de proteínas mediante sales seguido de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y HPLC entre otros.
En este trabajo se diseñaron estrategias con el fin de purificar dos bacteriocinas catiónicas producidas por Lactobacillus curvatus CRL705, lactocina 705 y lactocina AL705, activas frente a Lactobacillus plantarum CRL691 y Listeria innocua 7, respectivamente.
La precipitación con sulfato de amonio fue la etapa inicial y luego se realizó:
1) extracción orgánica con isopropanol,
2) cromatografía en fase sólida usando columnas C18 y elución con soluciones de isopropanol y acetato de amonio 200mM.
Por otro lado las bacteriocinas parcialmente purificadas se incorporaron mediante inmersión (soaking) en filmes destinados al envasado de salchichas a fin de obtener filmes activos antimicrobianos.
Metodología / Descripción Experimental
Microorganismos y condiciones de cultivo.
L. curvatus CRL705, productor de lactocina 705 y lactocina AL705 y L. plantarum CRL691 usado como indicador de lactocina 705, fueron aislados de embutidos artesanales Argentinos [4] L. curvatus CRL1579, obtenido a partir de L. curvatus CRL705 es productor de lactocina AL705 (compuesto antilisteria). Las cepas de Bl fueron cultivadas en MRS a 30ºC. Listeria innocua 7, indicador de lactocina AL705 (cedida por La Unité de Recherches Laitiéres et Génitique Appliqueé, Francia) fue cultivada en caldo TSB + extracto de levadura al 0.5% a 30ºC.
Obtención de bacteriocinas.
El cultivo libre de células de L. curvatus CRL705 se precipitó con sulfato de amonio (44%) como etapa inicial en todas las estrategias ensayadas. (1) Extracción con isopropanol: luego de la saturación con NaCl; se realizaron tres extracciones con isopropanol (1/4 del volumen inicial de la solución) [2]. (2) Cromatografía en fase sólida: se usó una columna C18[1] y como eluyentes 4 volumenes de acetato de amonio (200mM) + isopropanol al 10, 30, 40, 50 y 100%.
Los residuos de isopropanol fueron descartados en frascos de vidrio y almacenados en sala de residuos peligrosos hasta su posterior recolección.
Cuantificación de la actividad antimicrobiana y dosaje de proteínas.
La actividad antimicrobiana se determinó por el método de difusión en agar[3] usando como organismos sensibles L. plantarum CRL 691 y L. innocua.7 La concentración proteica se estableció mediante el método de Bradford.
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Obtención de filmes activos antimicrobianos.
Filmes multicapa de cara interna de polietileno se sumergieron durante 1 hora en las soluciones de bacteriocinas parcialmente purificadas. Luego de la incorporación, se lavaron con agua destilada estéril, se secaron a 50°C durante 10 minutos y se ensayaron frente a los microorganismos sensibles. Se realizaron controles negativos sumergiendo los filmes en isopropanol durante 1 hora.
Resultados
Purificación de las bacteriocinas
Si comparamos el porcentaje de proteínas eliminado respecto a la solución inicial para las distintas estrategias de purificación, se observa que por el método (2) se alcanza mayor pureza. (ver Fig 1)
estrategias de purificación. (1) Extracción con isopropanol, (2) Extracción en fase sólida.
Obtención de filmes activos antimicrobianos
Luego de sumergir un filme de cara interna de polietileno en la solución obtenida por (1) y lavarlo con agua, este presenta actividad antimicrobiana frente a L.innocua7 (ver Fig 3) y L.plantarum CRL691(ver Fig 4 ). No ocurre lo mismo para la solución activa obtenida por el método (2). Los controles negativos no presentaron actividad.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
.
% de proteinas eliminados
Fig. 1: Porcentaje de proteínas eliminadas respecto a la solución inicial. (1) Extracción con isopropanol. (2) Extracción en fase sólida
AL comparar las actividades relativas de las bacteriocinas parcialmente purificadas, se observa que en la extracción con isopropanol se obtiene una mayor actividad inhibitoria respecto a la extracción en fase sólida (ver Fig 2).
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
2
lactocina 705 lactocina AL705
Fig. 2: Actividad relativa (fracción purificada/fracción inicial) de las fracciones obtenidas mediante las distintas
Fig. 3: Filmes tratados con la solución de bacteriocinas parcialmente purificada obtenida por extracción con isopropanol ensayados frente a L.innocua7.
Fig. 4: Filmes tratados con la solución de bacteriocinas parcialmente purificada obtenida por extracción con
isopropanol ensayados frente a L.plantarum CRL691.
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Conclusiones Las sucesivas diluciones que se producen cuando se realiza extracción en fase sólida como método de purificación son las responsables de la disminución de la actividad antimicrobiana en el mismo, debido a la cual no se puede obtener un filme antimicrobiano por inmersión. En el caso de la extracción con isopropanol, además de la mayor actividad antimicrobiana obtenida, este método es simple y fácil de llevar a cabo, por ello fue elegido para la purificación parcial de las bacteriocinas. Si bien el isopropanol resulta nocivo en caso de ingestión o inhalación; en el proceso de desarrollo del filme antimicrobiano existe una etapa de lavado con agua y un posterior secado, con lo que se aseguraría la eliminación casi total del mismo. No obstante, este compuesto se encuentra en la lista positiva de aditivos para materiales plásticos destinados a la elaboración de envases en contacto con alimentos sin límite de restricción. [5]
La posibilidad de obtener envases con actividad antimicrobiana a partir de filmes para productos cárnicos permitiría evitar el deterioro del alimento debido a contaminaciones post-proceso.
Referencias
1.
Berjeaud Jean-Marc and Cenatiempo Yves.
Purification of Antilisterial Bacteriocins. Methods in Molecular
Biology, vol. 268: Public Health Microbiology: Methods and
Protocols.
2.
Burianek, L.L.and, Yousef, A.E. (2000) Solvent
extraction of bacteriocins from liquid cultures. Letters in
Applied Microbiology. 31, 193-197
3.
Nielsen, J.W., Dickson, J.S., and Crouse, J.D.
Use of a Bacteriocin Produced by Pediococcus acidilactici To
Inhibit Listeria monocytogenes Associated with Fresh Meat.
Applied and Environmental Microbiology. 56,7. 2142-2145
4.
Vignolo, G., Suriani F., R. Holgado, A y Oliver, G.
(1993) Antibacterial activity of Lactobacillus strains isolated
from dry fermented sausages. J. Appl. Bacteriol. . 75, 344-
349.
5.
Resolución MERCOSUR Nº 50/01. LISTA POSITIVA DE
ADITIVOS PARA MATERIALES PLÁSTICOS DESTINADOS A LA
ELABORACIÓN DE ENVASES Y EQUIPAMIENTOS EN CONTACTO
CON ALIMENTOS (MODIFICACIÓN DE LA RES. GMC Nº 95/94).
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