INMUNOSENSOR PARA LA CUANTIFICACION DE ALERGENOS ALIMENTARIOS UTILIZANDO TINTAS CON NANOTUBOS DE CARBONO Y PARTICULAS DE LATEX
Molinari J.,1 Medrano A.,2 Monsalve L.,2 Ybarra G.1 (1) INTI Procesos Superficiales; (2) INTI-CMNB
molinari@inti.gob.ar
Introducción
La alergia alimentaria es un problema mundial que impacta en la seguridad alimentaria y en la salud publica. Las proteínas de la leche de vaca son una de las principales causas de alergia alimentaria en niños menores de tres años, con una prevalencia en la población general que varía entre 2 y 3 %. Suele desarrollarse en las primeras semanas posteriores a su introducción en la dieta y en niños que están siendo alimentados con leche materna debido al consumo de leche de vaca por parte de la madre o al uso de fórmulas de leche infantiles que contienen las proteínas completas. La mayoría de los pacientes están sensibilizados a varias proteínas. Caseína, βlactoglobulina y α-lactoalbumina son los mayores alérgenos y los más abundantes en la leche de vaca. Más del 50% de los individuos alérgicos a la leche de vaca están sensibilizados a estas proteínas (65%, 61% y 51% respectivamente). Hay varias técnicas analíticas para la detección de estas proteínas. ELISA es el método más comúnmente usado en la industria alimentaria debido a su alta precisión, bajo límite de detección y alta especificidad, pero requiere una instrumentación y reactivos costosos. Los biosensores, dispositivos compactos que utilizan moléculas de reconocimiento específicas para los analitos de interés y combinan una electrónica integrada, son una alternativa económica a las técnicas disponibles en el mercado. Aunque en el campo de los biosensores en los últimos años se han generados muchos trabajos, el uso de biosensores electroquímicos para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos es escasos.
Objetivo
Desarrollar un método alternativo innovador, económico y de producción nacional para la detección y cuantificación de alérgenos en alimentos. Este proyecto en desarrollo se basó en la cuantificación de β-lactoglobulina, una proteína altamente alergénica de la leche.
instrumentación
electrónica,
llamado
potenciostato y por electrodos de carbono que
se conectan al equipo. El principio de detección
está basado en un inmunoensayo de captura
empleando
anticuerpos
inmovilizados
covalentemente a la superficie de los
electrodos. Sobre el electrodo ocurre el
reconocimiento del alérgeno de la muestra. Un
segundo anticuerpo conjugado a la enzima
peroxidasa de rabano picante (HRP) se une a
un epitope libre del alergeno del complejo
antígeno-anticuerpo unido al electrodo. La
medida electroquímica de la actividad
enzimática de la HRP luego de la adición de
peroxido de hidrogeno, un mediador rédox y la
aplicación de un potencial al electrodo, es una
corriente eléctrica procesada por un
potenciostato portable conectado a una PC vía
puerto USB. La señal eléctrica es proporcional
a la cantidad de alérgeno permitiendo su
cuantificación a través de una curva estándar
de calibración. Los electrodos de carbono de
trabajo y contraelectrodo fueron impresos
mediante la tecnología de película gruesa y
luego integrados en una celda electroquímica
acrílica Como electrodo de referencia se
empleó Ag|AgCl|0.1 M KCl. Los anticuerpos
son moléculas complejas cuyos sitios de
reconocimiento deben estar expuestos sobre la
superficie de los electrodos de carbono para
unirse a su antígeno específico. Los
anticuerpos se inmovilizaron por la reaccion de
carbodiimida entre los grupos amino primarios
del anticuerpo y los grupos carboxilos ubicados
sobre partículas de latex inmersas en la tinta de
nanotubos de carbono. Con dicha tinta se
pintaron los electrodos de trabajo de las celdas
elctroquímicas. Los parámetros del
inmunoensayo y condiciones de medición
fueron optimizados.
Descripción
El dispositivo consiste en un biosensor electroquímico amperométrico formado por una
Figura 1: Representación esquemática de la interacción antígeno-anticuerpo sobre el electrodo de carbono después del inmunoensayo captura y detección electroquímica por el mediador rédox (hidroquinona, H2Q, y 1,4-benzoquinona, BQ).
Figura 2: Impresión serigráfica de los electrodos de trabajo y contraelectrodos.
Resultados
Figura 3: Imagen SEM de electrodo de trabajo pintado con tinta de nanotubos de carbono y particulas de latex funcionalizadas con grupos carboxilos.
Bajo el método desarrollado, la concentración de β-lactoglobulina esta directamente relacionada a la medida de la corriente generada como se muestra en la Fig. 4. Las óptimas condiciones del sistema fueron encontradas para obtener un rango de cuantificación de 0.02 ppm hasta 20 ppm. Los parámetros optimizados fueron las concentraciones de anticuerpos primario inmovilizado y anticuerpo conjugado, así como los tiempos de incubación. El rango de medición es útil para el control de alérgenos en alimentos y la portabilidad del equipo representa una importante ventaja con respecto a los métodos comerciales disponibles en el mercado.
Figura 4. Curva corriente vs concentración. La corriente fue medida a los 60 s de aplicar un potencial de -280 mV con una concentracion de H2O2 de 1.5 mM usando diferentes concentraciones de β-lactoglobulina en la muestra.
Conclusiones
La determinación de alérgenos en alimentos es un tema de creciente preocupación. El desarrollo de un biosensor electroquímico amperométrico asociado a un inmunoensayo de captura presentado en este trabajo para la cuantificación de β-lactoglobulina tiene varias ventajas. El uso de tintas con nanotubos de carbono y partículas de latex funcionalizadas con grupos carboxilos ha permitido inmovilizar covalentemente los anticuerpos anti βlactoglobulina utilizados en el inmunoensayo en cantidad suficiente y con sus sitios de reconocimento expuestos en la superficie del electrodo como para lograr la sensibilidad adecuada para la cuantificación del alérgeno. Dicha inmovilización no fue efectiva cuando se generaron sobre la superficie del electrodo de carbono grupos carboxilos mediante el tratamiento con plasma. En ese caso, el número de grupos formados fue insuficiente para inmovilizar el número de anticuerpos necesarios para generar la adecuada sensibilidad en el inmunoensayo. No hay actualmente en la legislación de ningún país, a excepción de Japón, que establezca un límite de alérgenos en alimentos, pero generalmente se considera que trazas de alergenos puede conducir a reacciones alérgicas. En Japón este límite se estableció en 10 ppm, en tanto que el límite de detección logrado en este ensayo es del orden de 0.02 ppm.
Bibliografía
1. A. Fiocchi, J. Brozek, H. Schünemann, S. L. Bahna, A. von Berg, K. Beyer, M. Bozzola, J. Bradsher, E. Compalati, M. Ebisawa, M. A. Guzman, H. Li, R. G. Heine, P. Keith, G. Lack, M. Landi, A. Martelli, F. Rancé, H. Sampson, A. Stein, L. Terracciano, S. Vieths., Pediatr. Allergy Immunol. 21 (2010) 1-125. 2. G. Longinotti, G. Ybarra, P. Lloret, C. Moina, A. Ciochinni, D. Rey Serantes, L. Malatto, M. Roberti, S. Tropea, L. Fraigi, Engineering in Medicine and Biology Society, Annual International Conference of the IEEE, Buenos Aires, Argentina, 2010, 674-676. 3. C. Moina, G. Ybarra, “Fundamentals and applications of immunosensors” in “Advances in Immunoassay Technology”, InTech, Zagreb, Croatia, 2012. 4. R. Pilolli, L. Monaci, A. Visconti, Trends Anal. Chem. 47 (2013) 12-26. 5. J.Molinari, C.Moina, G. Ybarra, Electrochemical immunosensor for the determination of β-casein. J. Electrochem. Sci. Eng. 5(1) (2015) 9-16 6. R. Pedreschi, J. Nørgaard, A. Maquet, "Current Challenges in Detecting Food Allergens by Shotgun and Targeted Proteomic Approaches: A Case Study on Traces of Peanut Allergens in Baked Cookies". Nutrients 2012, 4, 132-150
Agradecimientos: A Paulina Lloret y Lionel Veiga por las imágenes SEM.
Ver+/-