Determinación de biomasa generada en un
bioproceso productivo por el método masa seca
Cancela Ezequiel, Cedrés Juan Pablo, Catone Mariela, Matos Maria Laura, Caro Carmen, Amedei Hugo Alejandro. Laboratorio Analítico, Cultivo Celular Masivo INTI-Biotecnología Industrial. cancela@inti.gob.ar
Objetivos
Evaluar el método de determinación de masa seca en microorgansimos de interés de la Industria Biotecnológica, cuantificando su incertidumbre.
Objetivos específicos
Estimar la incertidumbre relativa asociada a la medición de masa seca para una cepa de Escherichia coli. Estimar la incertidumbre relativa asociada a las medición de masa seca para una cepa de Picchia pastoris.
Introducción
La mayoría de los procesos industriales biotecnológicos implican el crecimiento controlado de microorganimos o células animales. A escala productiva, los microorganismos se emplean para generar productos de interés, entre ellos, biomasa, productos generados por el microorganismos (antibióticos, proteínas recombinantes) o saneamientos ambientales sobre una matriz contaminada. Para poder controlar dicho proceso es necesario estimar la variación de la cantidad de biomasa del microorganismo en función del tiempo. Existen varios métodos para determinar el crecimiento como ser medición de la densidad óptica determinando absorbancia a 600 nm (OD600), recuento microbiológico en placas y determinación de la masa seca del cultivo. Este método consiste en secar hasta peso constante un volumen conocido de muestra y determinar su masa gravimétricamente. La variación de la masa seca en función del tiempo, es la forma más utilizada para calcular el rendimiento productivo a lo largo del proceso. La forma tradicional de evaluar el rendimiento de un bioproceso en función del sustrato
consumido (Yx/s) se describe mediante la
siguiente ecuación:
=
∆ ∆
(Ec.1)
donde ΔX es la biomasa obtenida en el proceso, ΔS representa el sustrato principal empleado
para crecer el microorganismo. Dado que estos procesos requieren el control de crecimiento de la biomasa, es fundamental la estandarización y optimización del método teniendo en cuenta el adecuado dimensionamiento del volumen empleado para realizar las cuantificaciones y los procesos preparativos adicionales. Un resultado analítico, apto para su uso, implica que el mismo sea lo suficientemente fiable para que cualquier decisión basada en él, pueda ser tomada con confianza. Debe validarse el desempeño del método y estimar la incertidumbre del resultado, para un determinado nivel de confianza (1). La incertidumbre asociada a la precisión
intermedia (SRW) debe evaluarse bajo el mismo
método, la misma muestra homogénea, en un solo laboratorio, con diferentes analistas, con distinto equipamiento con intervalos de tiempo representativos de las actividades cotidianas del laboratorio. La misma puede calcularse a partir del promedio de cuadrados entre grupos obtenidos en el ANOVA, utilizando los cuadrados medios entre y dentro de los grupos según las ecuaciones 2 (2).
=
+
=(
!" − '
=
$ !" %
$ !" %)
(Ec.2)
donde s2mues se obtiene restando el cuadrado medio entre grupos (CMentre) y el cuadrado medio dentro de grupos (CMdentro), sobre el número de réplicas (n). sr2 es el cuadrado de la
desviación estándar asociada a la repetibilidad
del método. Si dicha incertidumbre se divide por
el promedio de las determinaciones totales
realizadas, se obtiene una incertidumbre relativa
denominada en este trabajo como urs.
La expresión de la incertidumbre combinada
relativa porcentual del método (uc(y)%) se
expresa como según la ecuación 3 (Ec.3).
78(9)% = 100 × = × 7> + 7>? + 7>@
(Ec.3)
donde k es el factor de cobertura considerado como 2. urs es la incertidumbre relativa a la precisión intermedia, urg es la incertidumbre relativa asociada por gravimetría y urv es la
incertidumbre relativa asociada por volumetría. El presente estudio propone el cálculo de la incertidumbre porcentual relativa de medición de Masa seca asociada a una cepa de E. coli, y a una levadura unicelular muy utilizada en Biotecnología como lo es P. pastoris.
Descripción
Se realizó un estudio de precisión intermedia del método sobre dos microorganismos: la bacteria E. coli y la levadura P. pastoris. El ensayo fue realizado considerando todas las variables implicadas en el método (distintos analistas e instrumentos de medición), con la salvedad de que por las características de la muestra se realizó el ensayo en un día de trabajo. El cálculo de incertidumbre relativa combinada final (Ec.3) expresada con un 95% de confianza (k = 2) involucró la incertidumbre de los instrumentos de medición (Ec.1) y la incertidumbre asociada al estudio de precisión intermedia (Ec.2).
Resultados
Para el cálculo de la desviación estándar relativa asociada a la incertidumbre por gravimetría se utilizó la incertidumbre de 0,1 mg (3) en el rango utilizado. Además, el promedio de pesos obtenido para P. pastoris fue de 10,8 mg y 7,8 mg para E. coli. Las incertidumbres relativas calculadas fueron: para las muestras de P. pastoris fue 0,009 g y para E. coli fue de 0,013 g. En relación al cálculo de la incertidumbre relativa asociada a los volúmenes de trabajo, la incertidumbre para la pipeta utilizada fue de 10 µl (4). El volumen empleado para P. pastoris fue de 0,7 y para E.coli de 3,2 ml. Las incertidumbres relativas calculadas para la
gravimetria (urg) y volumetría (urv) fueron
calculadas según las ecuaciones 4 (Ec.4) y 5 (Ec.5) respectivamente:
7>? = 7(?) ?
(Ec.4)
7>@ = 7(@) @
(Ec.5)
donde u(g) y u(v) son las incertidumbres del
instrumento gravimétricos y volumétricos, g y v
se corresponden con el peso y el volumen
medido respectivamente.
La precisión intermedia (Srw) calculada según la
ecuación Ec.2 fue dividida por el promedio de las
mediciones realizadas obteniéndose el término
urs (Ec.3). Finalmente los resultados (uc%) que
se expresan en la tabla 1 fueron calculados
utilizando la ecuación 3 (Ec.3).
Tipo celular
Procariota
Clasificación Bacteria
Organismo E. coli
Valor determina do (g/l)
2,4
uc% 11,7
Eucariota Levadura
P. pastoris
15,4
12,5
Tabla 1: Resultados de las incertidumbres calculadas para distintos microorganismos sobre muestras de distintos contenido de masa seca.
Con el fin de estudiar de forma generalizada las incertidumbres de medición, comparar el comportamiento de cada organismo respecto del peso seco detectado, trabajar con una cantidad constante de muestra a secar y que a su vez sea la menor cantidad de muestra destructiva utilizada, se evaluó el volumen de cultivo necesario para obtener 8 mg (superior al límite de cuantificación de la técnica) de peso seco normalizada respecto de la OD600 de cultivo para cada cepa, como “factor” (Figura 1).
Factor (ml/OD)
40 35 30 25 20 15 10
5 0
LB LB LB MRS YPD YPD Sintético
Figura 1: Comparación de los distintos factores obtenidos para bacterias (gama de verdes) y para levaduras (gama de naranjas).
Conclusiones
Este estudio le permitirán al Centro de
Biotecnología
Industrial
satisfacer
requerimientos metrológicos tanto de empresas
biotecnológicas nacionales como propios. Se
observa una variación de la incertidumbre
creciente con la cantidad de analito medida para
los valores de células testeados.
Al calcular las incertidumbres relativas en
distintos valores de analito (2,4 g/l para E. coli y
15,4 g/l para P. patoris) se observan
incertidumbres de medición crecientes, sugiriendo que la forma más adecuada para la expresión de la incertidumbre en el rango evaluado es la incertidumbre relativa. El cálculo de incertidumbre fue realizado considerando la incertidumbre generada por la precisión del método más el estudio de la incertidumbre asociada a la exactitud, la cual se basó en la propagación de incertidumbres del instrumental, lo cual explica en gran medida la incertidumbre asociada al sesgo dado que la pesada final es la que define el valor a expresar y no se requiere para dicho método interpolar en una curva de estándar como en la mayoría de otros métodos. Una alternativa para estimar la incertidumbre asociada al sesgo, sería realizar el clásico estudio con un material de referencia, del cual no se dispone. Se requieren estudios posteriores a fin de obtener un estimación generalizada de la
incertidumbre del método aplicable a todas las cepas que se muestras en la figura 1.
Bibliografía
(1) Eurolab Española. P.P. Morillas y colaboradores. Guía Eurachem: La adecuación al uso de los métodos analíticos- Una Guía de laboratorio para la validación de métodos y temas relacionados (1° ed. 2016).
(2) Curso de validación de Métodos Analíticos y Control de Calidad en Laboratorios. Intituto Nacional de Tecnología Industrial. 3, 4 y 5 de mayo 2017. Lic. Pablo Alvarez.
(3) Certificado de calibración / medición para balanza analítica Sartorius (RUT- N°102-3438/U) Centro de Investigación y Desarrollo Física y Metrología – INTI.
(4) UNE-EN-ISO 8655-2: 2002. Madrid: AENOR; 2002ISO 8655 Calibracion de Pipetas. Apartado 2.
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