DESARROLLO DE MÉTODO DE EVALUACIÓN DE CITOTOXICIDAD UTILIZANDO CÉLULAS DE MAMÍFERO
Sara Reidel, Martín Blasco, Maria Laura Matos Centro de Investigación y Desarrollo en Biotecnología Industrial-INTI
sreidel@inti.gob.ar
Introducción
El ensayo de citotoxicidad forma parte de un conjunto de ensayos utilizados en el estudio del efecto de materiales y/o compuesto sobre el crecimiento, duplicación y morfología de células con el objetivo de definir su inocuidad para el epitelio humano. La evaluación de la citotoxicidad mediante observación de morfología y cuantificación de actividad biológica ofrece una alternativa simple, rápida y de alta sensibilidad. Además es una de las técnicas propuestas para disminuir el uso de animales en pruebas toxicológicas. La International Standard Organization (ISO) en su norma 10993-5 propone tres variantes de ensayos para evaluar la citotoxicidad; utilizando extractos, mediante contacto directo o contacto indirecto con el material. En estas tres variantes, la evaluación de la viabilidad celular se realiza utilizando un indicador de la actividad deshidrogenasa mitocondrial, el 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) y un acoplante de la transferencia de electrones, el 5-metilsulfato de metilfenazinio (PMS)1. Como compuestos modelo de citotoxicidad la norma propone el dodecilsulfato de sodio (SDS) como compuesto citotóxico soluble, mientras que sugiere el látex como material conteniendo lixiviables citotóxicos, para ensayos de citotoxicidad precedidos de extracción2. En el presente artículo se presenta la puesta a punto del ensayo de evaluación de la citotoxicidad mediante MTS-PMS y observación microscópica de los cultivos. El comportamiento típico de un material citotóxico en un ensayo de este tipo es la disminución de la viabilidad celular del 30 % respecto de un control sin tratamiento (Figura 1).
Objetivo
Validación y puesta a punto de un ensayo simple y rápido que permita evaluar la citotoxicidad de elementos y compuestos para aplicaciones susceptibles a compuestos citotóxicos (por ej. elementos en contacto con alimentos, tejidos, células).
Descripción
El estudio del ensayo se realizó mediante un diseño factorial de tres factores y cuatro niveles, los factores fueron: número de células iniciales (5000, 10000, 15000, 20000), concentración del MTS-PMS (0,25; 0,5; 0,75; 1X) y horas de incubación (1; 2; 3; 4 h). Adicionalmente se evaluaron tiempos intermedios (1,5; 2,5 h).
Cultivo de células (viabilidad control) Las células VERO se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con antibiótico, antimicótico y 10% de suero fetal bovino (DMEM-C-SFB). En la primera etapa (G1), las células se sembraron a razón de 5x104 células/pocillo en placa de 96 pozos (p96) y se cultivaron a 37± 1°C y 5% de CO2 24 ± 2 hs. En una segunda etapa (G2), se reemplazó el medio y se incubaron por 24 ± 2 hs. Finalmente se evaluó la morfología al microscopio y la viabilidad mediante MTS-PMS.
Método de detección El MTS reducido por las deshidrogenasas de las células metabólicamente activas produce un formazan detectable a 490 nm1. Se optimizaron las condiciones del ensayo evaluando la correlación y sensiblidad entre el número de células y la respuesta (Abs 490 nm). Adicionalmente, se evaluó el resultado obtenido con el valor esperado, de los puntos críticos en el ensayo de citotoxicidad.
Figura 1: Perfil de respuesta esperado para el crecimiento de células (serie azul) y el tratamiento con un agente citotóxico a partir de las 24 h de cultivo (serie naranja).
Desarrollo del ensayo Como control positivo del ensayo se utilizaron diluciones de dodecilsulfato sódico (SDS; Grado electroforesis, Bio Rad) de modo de determinar la concentración inhibitoria 50 (CI50). Para el control negativo (VC) las células se trataron con DMEM-C-SFB fresco. El blanco consistió en DMEM-C-SFB incubado en pocillos sin células siguiendo el esquema del ensayo (G1 y G2).
# Células calculadas VIABILIDAD RELATIVA %
Para ambos controles, se utilizará el intervalo de confianza 95 (IC95) como criterio de aceptación del ensayo. Para evaluar compuestos de contacto directo, se prepararon diluciones con DMEM-C-SFB y se aplicaron en la etapa G2.
Extracción y ensayo de lixiviables Los extractos se obtuvieron poniendo en contacto dentro de un contenedor no citotóxico 1,0 ml de DMEM-C-SFB con el material a estudiar a 37°C, con agitación lineal (2 hz) durante por 24 ± 2 hs. Los extractos y sus diluciones seriadas al medio en DMEM-SFB se utilizaron como medio en la etapa G2. El control positivo para la extracción de lixiviables del material citotóxico se realizó con discos de 6 cm2 de guantes de látex (Coronet® Seiseme S.A.). En este ensayo, la norma indica que la dilución al medio del extracto debe arrojar una viabilidad mayor o igual a la del extracto original 2.
Cálculo de la viabilidad celular La “viabilidad relativa” porcentual a las células creciendo en DMEM-C-SFB, rotuladas como “Control negativo” (VC), se calculó según la ec. 1.
= × 100 (Ec. 1)
Donde, a es absorbancia de la muestra b es absorbancia del blanco c es absorbancia del control negativo.
El control negativo se realizó 12 veces por ensayo. Los ensayos de las muestras se realizan por triplicado, utilizándose el promedio para los cálculos.
Resultados
Método de detección
45
1
40
2
35
3
4
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
# células sembradas
Figura 2: Perfil de respuesta para número final de células
sembradas a partir de recuento y posterior dilución (revelado
con MTS 1X).Cada serie representa un tiempo de incubación
en horas.
La respuesta del método al número de células (Figura 2) indica que en la medida que aumenta
el número de células la sensibilidad analítica (pendiente) disminuye. Esto impone una restricción al número de células al momento de definir las condiciones óptimas del ensayo. Es Entre 10000 y 20000 células la sensibilidad resulta máxima, mientras que incubando dos horas se obtiene la dispersión mínima del número de células calculado (resultados no mostrados). Por otro lado, en estas condiciones se observa mayor exactitud en la relación de número de células calculadas y el número de células sembradas. El efecto de la disminución de la concentración de MTS produjo una disminución en la sensibilidad analítica y un aumento en la dispersión (resultados no mostrados).
Control de calidad del ensayo El IC95 del control negativo resultó en el rango 1,17-1,32 (unidades de absorbancia). Mientras que para la CI50 del control positivo (SDS) dicho intervalo resultó 0,144- 0,159 (mg/ml).
Control de extracción La evaluación de la citotoxicidad de los lixiviables del latex indica que las diluciones 1/16 y 1/32 serían adecuadas para el control del ensayo (figura 3).
120
100
80
60
40
20
0
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
LOG10 (DILUCIÓN DEL EXTRACTO)
Figura 3: Perfil representativo de la viabilidad relativa porcentual en función del log10 de la dilución del extracto del látex.
Conclusiones
Teniendo en cuenta la respuesta, dispersión y
exactitud de los resultados, las condiciones del
ensayo se definieron en: 5000 células iniciales,
2 horas de incubación, MTS 1X.
Se desarrolló un método de cuantificación de
citotoxicidad para materiales y compuestos
ampliando la oferta tecnológica del Centro de
Biotecnología Industrial y potenciando las
capacidades del INTI en el desarrollo de
soluciones tecnológicas integrales para
aplicaciones en humanos y otros animales.
Bibliografía
1. Barltrop, J.A. et al. (1991) Bioorg. Med. Chem. Lett.1, 611-4.
2. ISO 10993:2009-5; ISO 10993:2004-12
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