DESARROLLO DE METODOLOGÍA DE CULTIVO EN PLACAS DE POZOS PROFUNDOS (Scaling down).
CARACTERIZACIÓN DE PARÁMETROS
L. Navarro, M. Blasco INTI Biotecnología lnavarro@inti.gob.ar
Introducción
El desarrollo de cepas de microorganismos con alta productividad es un hito fundamental en el desarrollo de bioprocesos competitivos. El scaling down consiste en simular las condiciones productivas a baja escala, con la finalidad de realizar procesos de selección luego extrapolables a la escala de producción. La capacidad de transferencia de oxígeno es uno de los factores más importantes en el escalado de bioprocesos aeróbicos ya que define la cantidad de biomasa que puede soportar una metodología de cultivo. El parámetro que permite caracterizar la capacidad de transferir oxígeno en un sistema gas-líquido es el KLa, según ec. 1:
& = "∗ − " ecuación 1 2
donde: OTR = tasa de transferencia de oxígeno (mol · L-1 · h-1). C*O2 = concentración de saturación de O2 en la interfase (mol · L-1).* CL = concentración de O2 en el seno del líquido (mol · L-1).* *Constantes para una temperatura y composición de la solución específica1.
El método del sulfito permite medir el OTR1 al basarse en la oxidación del sulfito a sulfato, produciendo la acidificación de la solución:
2− 3
+
0,5
2
2− 4
ecuación
2
· −1 · ℎ−1 = "# 2 3 × % 2 ecuación 3 × %# 2 3
donde: CNa2SO3 = concentración de sulfito oxidado hasta pH de detección (g · L-1). VO2 = coeficiente estequiométrico del oxígeno. VNa2SO3 = coeficiente estequiométrico del sulfito. t = tiempo de reacción hasta pH de detección, dependiente de la velocidad de transferencia de oxígeno del medio gaseoso al medio líquido1.
En este trabajo presentamos la caracterización del proceso de transferencia en placas de pozos profundos mediante la reacción del sulfito con oxígeno acoplada a un indicador ácido-base y seguida mediante un sistema óptico.
Objetivo
Caracterizar sistemas de cultivo a microescala por su capacidad de transferencia de oxígeno.
Descripción
Medición de intensidad de color rojo-verde-azul (RGB) para la determinación del pH Se acidificó una solución de composición similar a la utilizada para caracterizar la transferencia de oxígeno (NaCl 0,75 M, CoSO4 1x10-4 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,012 M, azul de bromotimol 2,4x10-5 M, pH=8, ver más adelante). El NaCl reemplazó al sulfito para evitar modificación en el pH por oxidación del mismo. Se obtuvieron 12 valores de pH (pHREF) entre 8 y 3,3 midiendo con un pHmetro. Se transfirió por triplicado cada punto de pH a una microplaca. La placa fue fijada en el centro de una caja plástica con una cámara VGA e iluminación LED controlada. Las imágenes fueron analizadas mediante el programa ImageJ (NIH, EEUU). Brevemente las imágenes se descompusieron en los canales R, G y B y se analizaron las regiones de interés (ROIs) de idéntico tamaño y coordenadas en cada uno de los canales. El rango dinámico se determinó a partir de los valores de intensidad en los tres canales (R, G, B) cuya regresión con el pHREF presentó un valor de R2 mayor a 0,99.
Selección de la mejor combinación de colores Se obtuvo el valor de pHRGB introduciendo el valor de intensidad en la ecuación de la línea de tendencia obtenida a partir del graficó de intensidad RGB vs pHREF. Con estos valores se determinó la correlación del pHRGB (obtenido para cada color o combinación de colores cuando se promedio el pHRGB de cada color de la combinación) con el pHREF. El mejor color o combinación de colores para medir el pHRGB se determinó considerando el mayor valor de R2 (triplicados experimentales) y se realizó una prueba estadística t para evaluar diferencias entre ambos métodos en la medición del pH.
Determinación de la transferencia de oxígeno en microplacas Las determinaciones de OTR se calcularon según ec. 3, utilizando una solución conteniendo sulfito (Na2SO3 0,5 M, CoSO4 1x10-4 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,012 M, azul de bromotimol 2,4x10-5 M, pH=8) en función de la velocidad de agitación en vueltas por minuto
(RPM), tipo de placa (Placa) y volumen de llenado (Vol.)1. Se utilizó la curva patrón caracterizada anteriormente. El pH se determinó mediante el análisis de las fotografías tomadas cada 10 seg hasta la observación del pHRGB correspondiente al punto final (pH = 6) Con cada valor de OTR se calculó según ec. 1 el KLa de las distintas condiciones, y se lo comparó con los reportados en la bibliografía.
Resultados
Rango dinámico Los rangos dinámicos para la determinación del pHRGB se definieron a partir de la región lineal observada en el ensayo (Fig. 1; solo se muestran los valores correspondientes a la zona de ajuste con R2>0,99).
Figura 1: Selección rango dinámico. Intensidad de cada color vs pHREF.
Los resultados de dicho ajuste fueron: a. pHref 6,06-7,73 para el color azul b. pHref 5,85-7,73 para el color verde c. pHref 5,85-7,73 para el color rojo
Mejor color o combinación de colores Las combinaciones de colores presentaron un R2 mayor a 0,99 en tres de las cuatro combinaciones, mientras que cada color por separado no superó el valor de 0,98. La combinación de colores azul y rojo fue la que mayor ajuste lineal presentó (R2=0,996, Fig. 2).
Figura 2: Selección del mejor color. pHRGB vs pHREF de la combinación rojo-azul.
No hubo diferencias estadísticas entre pHREF y pHRGB, por lo que se eligió la combinación azulrojo para la medición del mismo.
Determinación de la transferencia de oxígeno
en microplacas
El KLa aumentó al incrementar la velocidad de
agitación. En contraste, el volumen de llenado
impactó negativamente sobre el valor de este
parámetro (Fig. 3).
b)
*** p<0.05
400 318 ± 23
300
200 ± 7 200
KLa (h-1)
100 39 ± 1
0
400
RPM,
200
µL,
0
°,
PPP 400
RPM,
500
µL,
0
°,
PPP 400
RPM,
200
µL,
0
°,
PE
Figura 3: Determinación de la transferencia de oxígeno.
El valor máximo obtenido de KLa fue 318 ± 23 h-1 (n=2) para la condición 400 RPM, 200 uL en placa PPP (Fig.3). Los resultados obtenidos en la caracterización, son comparables con los presentados en la literatura (400 h-1, 0,1-1 L2; 60-360 h-1, 1-30 L3; 170-740 h-1, 30-2000 L3).
Conclusiones
- El método desarrollado para medir pH en
función de la intensidad generó la herramienta necesaria para poder realizar la caracterización de los sistemas de cultivo en microplaca. - Con los valores de KLa y OTRmax obtenidos se logró definir los parámetros de transferencia de O2 de un sistema de selección de cepas de alto rendimiento y compararlos con biorreactor de tipo tanque agitado típico. La definición de las condiciones de operación en uno de los sistemas permitiría definir las condiciones en el otro para obtener resultados comparables.
Bibliografía
1. Hermann, R., Lehmann, M., Buchs, J.
(2003). Characterization of gas-liquid mass
transfer phenomena in microtiter plates.
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2. Gill, N.K., Appleton, M., Baganz, F., Lye, G.J.
(2008). Design and characterisation of a
miniature stirred bioreactor system for parallel
microbial
fermentations.
Biochemical
Engineering Journal, 39(1), 164–176.
3. Junker, B.H. (2004). Scale-up methodologies
for Escherichia coli and yeast fermentation
processes. Journal of Bioscience
Bioengineering, 97(6), 347–364.
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