Optimización de proceso y escalado de VIREST. Un nuevo principio activo para el tratamiento de conjuntivitis virales.
L. Gandolfi, D. Fischer, C. García, E. Elhalem, M. Córdoba, M.J. Comin Programa de Fortalecimiento de la Cadena de Valor de la Industria Farmacéutica y Farmoquímica
INTI Química gandolfi@inti.gob.ar
Introducción
Virest es un nuevo compuesto con actividad antiviral y antiinflamatoria desarrollado por investigadores de la Facultad de Cs. Exactas y Naturales, UBA.(Michelini et al, 2008) La sustancia fue patentada en la Argentina, USA y UE, y su desarrollo como medicamento lo realiza el Instituto Massone, una empresa farmacéutica de capitales nacionales.(Ramirez et al, 2009) El rol del INTI fue el desarrollo de un proceso de síntesis a escala que permitió obtener material suficiente para la realización de ensayos preclínicos en animales. Este nuevo principio activo se presenta como una opción efectiva para tratar la conjuntivitis viral, para la cual aún no existe tratamiento específico, evitando el uso de corticoides y sus efectos adversos. Este proyecto es uno de los pioneros en el país para el desarrollo de un fármaco “de novo” con capitales nacionales y que surge de la conexión entre grupos de investigación de instituciones públicas y la Industria Nacional.
Objetivo
Desarrollo de un proceso simple, escalable, eficiente y robusto para la producción de VIREST en escala multigramo.
Descripción
La metodología sintética desarrollada a escala laboratorio (1-2 g) por los investigadores de FCEyN-UBA involucraba dos pasos a partir de un análogo del estigmatano comercial (MPC, Figura 1), con un rendimiento global de 54% y pureza de producto final ≥ 99%. Las condiciones utilizadas no eran compatibles con un cambio de escala. Primer Paso: Oxidación de Oppenauer. Obtención del Intermediario 1 (I-1). Consiste en la oxidación a cetona de un alcohol secundario presente en MPC por acción de isopropóxido de aluminio y N-metilpiperidona.
Figura 1: Representación esquemática de la síntesis de VIREST. MPC: material de partida comercial, I1: intermediario 1
Segundo Paso: Dihidroxilación de Sharpless. Obtención de VIREST. Se basa en una reacción de dihidroxilación asimétrica de Sharpless (ADH) en dónde uno de los dos alquenos de I1 es transformado estereoselectivamente al diol syn por acción oxidativa de un reactivo de Os (catalítico) en presencia de un auxiliar quiral y un agente reoxidante (ARox) obteniéndose VIREST. Esta mezcla de reactivos se la denomina ADmix (Figura 2).
Figura 2. Dihidroxilación asimétrica de Sharpless (ADH)
En este trabajo se describen las modificaciones realizadas al proceso de laboratorio original para convertirlo en un proceso escalable.
Resultados
Metodología de Trabajo: Partiendo del
procedimiento informado por el solicitante, se
diseñó una serie de ensayos que nos
permitieron detectar las variables claves de
proceso y optimizarlas hasta llegar a un
procedimiento sencillo, eficiente y fácil de
escalar. En cada caso se comparó la relación
del producto mayoritario de reacción vs. las
impurezas principales de proceso de cada
crudo obtenido por RMN 1H.
Optimización y escalado primer paso:
Oxidación.
Se diseñaron ocho experiementos que nos
permitieron lograr notables mejoras respecto
del proceso original.
Principales mejoras de proceso logradas:
Reducción de costos
y
simplificación:
Reemplazo de solvente de reacción anhidro
por solvente calidad ACS y disminución del 38
% del volumen.
Ahorro energético: reducción de tiempos de
enfriamiento y calentamiento. Eliminación de la
operación de destilación a sequedad de la fase orgánica. Eliminación de formación de emulsiones.
Reducción de los volúmenes de soluciones de lavado (60%).
Estandarización de proceso: Definición de puntos de detención y de control de proceso. Definición de volumen de solvente de recristalización logrando reproducibilidad en esta operación. Desarrollo de método HPLC-IR para el análisis de pureza del intermediario 1.
Se logró obtener el intermediario 1 puro (≥99 %) con muy buen rendimiento (81%) a través de un proceso simplificado, robusto y reproducible. Escala alcanzada: 100 g.
Optimización y escalado segundo paso: Dihidroxilación de Sharpless. Cambios cruciales incorporados que permitieron lograr un proceso escalable:
Reemplazo del agente reoxidante (ARox): El uso del ARox descripto en el proceso original (ARox1) no era compatible con el escalado: se generaban subproductos y grandes cantidades de sales que complicaban las operaciones del tratamiento de reacción. En base a antecedentes bibliográficos, se encontró una alternativa a este reactivo: ARox2, y se ensayó su performance. Se encontraron condiciones de reacción con ARox2 que conducían a resultados similares a las obtenidas con en el proceso original, pero con tiempos de reacción más largos y menor selectividad.
Maximización de la conversión y la regioselectividad de la reacción: Las principales impurezas de este paso consistían en el intermediario 1 (I-1) y el tetraol (producto de la sobreoxidación de VIREST, Figura 1). A fin de definir el punto final de reacción, se realizó un estudio cinético que mostró que en una primera etapa, la velocidad de formación de tetraol se mantenía constante pero, una vez consumido el compuesto de partida (I-1) aumentaba la pendiente de la curva de tetraol en detrimento de la de VIREST, indicando ese momento como punto de corte de reacción (Fig.3)
Cambio de T reacción Con el objeto de disminuir los tiempos del proceso, se realizaron experimentos a distintas T lográndose reducir al quinto los tiempos de reacción termostatizando el sistema a 45oC.
Cambio del work up y método de purificación: Se incorporó el uso de Na2SO3 en lugar de NaHSO3 como agente reductor del Os remanente durante el work up y se obtuvieron crudos recristalizables. Se realizó una búsqueda de solvente y se optimizó el método de recristalización logrando obtener VIREST con una alta pureza (>98%, HPLC) eliminando
la cromatografía en columna utilizada en el proceso original que resulta altamente costosa para aplicar en escala multigramo y en producción.
90
80
70
60
AU
%
50 I-1%
40 virest %
30
tetraol%
20
10
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
tiempo (h)
Figura 3. Estudio cinético del segundo paso.
Concentraciones relativas medidas por RMN
Preparación de estándar secundario
y desarrollo de método HPLC-DAD:
Hasta el momento no existía método de
análisis HPLC de VIREST. Desarrollamos un
método de cuantificación de pureza por HPLC-
DAD (240nm) contra patrón secundario de
VIREST sintetizado en el laboratorio, que nos
permitió analizar la pureza de los lotes de
VIREST producidos.
7A87PC221C\_1\_24May16\_UV\_1 Sm (Mn, 2x3) 3.6e-1
78425
3.4e-1
3.2e-1
3.0e-1
2.8e-1
2.6e-1
2.4e-1
2.2e-1
2.0e-1
1.8e-1
1.6e-1
1.4e-1
1.2e-1
1.0e-1
8.0e-2
6.0e-2
4.0e-2
2.0e-2
0.0
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Figura 4. Cromatograma
Time 3.68
Height 368290
2: Diode Array
240 Range: 3.796e-1
Area Area Area% 78425.11 100.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
de VIREST lote
14.00
Ti me 15.00
20 G
con
detección UV a 240nm
Conclusiones
√ Se desarrolló un proceso robusto, escalable y reproducible para la síntesis de VIREST.
√ El proceso desarrollado permitió producir un lote de 20 g de VIREST con 98.1% de pureza (HPLC) y un rendimiento global de 37 % que permitió avanzar en los estudios preclínicos de la droga.
√ Ensayos preclínicos realizados con VIREST sintetizado, demostraron que actúa contra la mayoría de las conjuntivitis virales y reduce la inflamación sin generar los efectos colaterales de los corticoides.
√ Actualmente la droga también está siendo estudiada en otras aplicaciones.
Bibliografía
- Michelini, F. M., Ramírez, J. A., Berra, A., Galagovsky, L. R., & Alché, L. E. (2008). Anti-herpetic and antiinflammatory activities of two new synthetic 22 , 23dihydroxylated stigmastane derivatives. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 111, 111–116. doi:10.1016/j.jsbmb.2008.05.005 - Ramirez, J. A., Michelini, F. M., Galagovsky, L. R., Berra, A., & Alche. (2009). WO2009007895A2.
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