PEPTIDASAS VEGETALES COMO ALTERNATIVA ECOCOMPATIBLE PARA LA TECNOLOGÍA DEL CUERO
M.E. Errasti, J.E. Martegani, G. Mazzilli, L.M.I. López INTI Cuero
jemartegani@inti.gob.ar
Introducción
La industria curtidora es una de las más tradicionales de nuestro país, con un alto impacto en la generación de empleo y en la balanza comercial. Se revela como el primer eslabón en la generación de valor agregado al transformar un subproducto de la industria cárnica, la piel, en un producto que satisface diversas necesidades humanas, el cuero. Sin embargo, a través del complejo proceso tecnológico del curtido se generan una variedad de desechos. En este sentido resulta fundamental incorporar procesos y sistemas más eficientes para el tratamiento de los efluentes. El depilado enzimático mediante uso de proteasas constituye una alternativa biotecnológica eco-compatible ya que, además de eliminar el riesgo en la producción de SH2, disminuye significativamente las DBO y DQO de los efluentes (Dettmer et al., 2012). Un beneficio adicional muy interesante es que las proteasas son biocatalizadores de naturaleza no tóxica y autodegradables.
Objetivo
A partir del látex de frutos de Bromelia hieronymi (Bh), B. balanseae (Bb) y Pseudanana macrodontes (Pm) se obtuvieron extractos con alta actividad proteolítica que fueron ampliamente caracterizados (Bruno et al., 2011; Pardo et al., 2000; López et al. 2001), El objetivo del presente trabajo fue evaluar la potencial aplicación de dichas preparaciones enzimáticas en la industria del cuero como agentes depilantes así como para el tratamiento de los residuos proteicos generados en dicha industria
Descripción
Obtención de extractos. Los frutos fueron triturados en un medio buffer adecuado, centrifugados y liofilizados. Las preparaciones crudas fueron sometidas a una purificación inicial por precipitación acetónica, acetónica/TCA. La determinación de proteínas se realizó empleando el método de Bradford. Actividades enzimáticas. Se usaron diferentes sustratos representativos de proteínas de la piel (Cantera et al., 2003): polvo azul de piel
(HPA), azul de queratina, elastina rojo congo y
sustrato epidermis como representativos de
colágeno, queratina, elastina y capa epidermis,
respectivamente. La actividad proteolítica total
fue evaluada usando caseína como sustrato
(Torres et al., 2010). Las actividades fueron
medidas a 25, 35 y 55 ºC en buffer Tris-HCl 0,1
M y pH 8 conteniendo cisteína 20 mM. Las
actividades enzimáticas determinadas frente a
queratina fueron expresadas en unidades
queratinolíticas (UKA), frente a colágeno como
unidades colagenolíticas (UHPA), frente a
elastina como unidades elastinolíticas (UE) y
frente al sustrato epidermis como unidades
epidermis (UEP) Los valores fueron
comparados con el de una enzima depilante
comercial (New 1875, Cergen).
Acción depilante: Muestras de piel vacuna (4 g)
fueron
incubadas
con
diferentes
concentraciones de enzimas vegetales en
buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 con cisteína 20 mM
durante 24 h a 25 ºC. El efecto depilante fue
evaluado por un raspado superficial suave.
Superficies y cortes transversales de las pieles
tratadas fueron observadas mediante
microscopía electrónica (SEM).
Resultados
Tabla 1: Actividad frente a caseína y concentración de proteínas
En la Tabla 1 se muestran los resultados de la actividad proteolítica sobre caseína (CU) y concentración de proteínas totales que presentan los extractos enzimáticos vegetales y la preparación enzimática comercial
Muestras
Actividad Protein as Actividad
Proteolítica (µgpro/mg) específica
(CU/mg)
(CU/gpro)
Bb
3,38 ±
0,04 ± 0,01 0,06
12
Bh
0,17 ±0,02 22 ± 3 8
Pm
0,09 ± 0,02 15 ± 4 6
New1875 0,09 ± 0,01 6 ± 1
15
Las actividades enzimáticas determinadas
frente a queratina, colágeno, elastina y
sustrato epidermis, se muestran en la Tabla 2.
Los resultados muestran que las enzimas
vegetales son capaces de degradar queratina,
colágeno y el sustrato epidermis, en tanto que frente a elastina las actividades fueron muy bajas. Para igual actividad proteolítica Bb, Bh y Pm mostraron similar actividad colagenolítica y actividad sobre epidermis, ligeramente menores que las del producto enzimático comercial. Las actividades aumentaron notariamente con la temperatura (hasta los 55°C).
Muestra UKA/CU UHPA/CU UE/CU UEP/CU
Bb
1 ± 0.3 1840 ± 93 1.1 ± 0.2 17 ± 5
Bh
7±3
Pm
5±1
New1875 5 ± 1
2052 ± 75 2.5 ± 0.3 22 ± 5
2305 255
2468 235
± 0.46 0.04
± 29 ± 3
± 98.0 ± 2 45 ± 2
Tabla 2: Actividad frente a sustratos representativos de la piel animal
La actividad depilante de piel vacuna fue evaluada por microscopía electrónica (Figura 1). Se evidenció que los pelos y la capa epidermis resultaron totalmente eliminados de las pieles tratadas, mostrando características deseables para un agente depilante: poros limpios sin pelos residuales, superficie limpia e intacta y fibras de colágeno no dañadas.
inferir que las fitopetidasas estudiadas podrían ser utilizadas como biocatalizadores en el tratamiento de los residuos de la industria del cuero para degradar las proteínas presentes en los efluentes líquidos y sólidos que se generan. Además, los resultados obtenidos en los ensayos de depilado evidencian que Bb, Bh y Pm representan preparaciones enzimáticas de origen vegetal novedosas con potencialidades para ser utilizadas como agentes depilantes eco-compatibles y seguros en la industria del cuero
Bibliografía
Bruno MA, Trejo SA, Avilés FX, Caffini NO and López LM (2011) “Cloning, Sequencing, and Identification Using Proteomic Tools of a Protease from Bromelia hieronymi Mez.” Appl Biochem Biotechnol. 165:583-593. Cantera, C.S., Goya, L., Galarza, B., Garro M.L. and Lopez, L.M.I. (2003) Hair saving unhairing process. Part 5 Characterisation of enzymatic preparations applied in soaking and unhairing processes. J. Soc. Leath. Tech. Chem,. 87, 69-77. Dettmer, A., Cavalli, É., Ayub,M.A. and Gutterres, M. (2012) Optimization of the unhairing leather processing with enzymes and the evaluation of inter-fibrillary proteins removal: an environment-friendly alternative. Bioprocess Biosyst. Eng., 35, 1317-1324. López, L.M.I., C. Sequeiros, S.A. Trejo, M.F. Pardo, N. O. Caffini and C.L. Natalucci (2001) "Comparison of Two Cysteine Endopeptidases from Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae)", Biological Chemistry
Hoppe-Seyler 382: 875-878.
Pardo, M.F., L.M.I. López, C.L. Natalucci, F. Canals, F.X. Avilés & N.O. Caffini (2000). “Purification of Balansain I, an Endopeptidase from Unripe Fruits of Bromelia balansae Mez (Bromeliaceae)". Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 3795-800. Torres, M.J., Trejo, S.A., Martin, M.I., Natalucci, C.L., Avilés, F.X. and López L.M.I. (2010) “Purification and Characterization of a Cysteine Endopetidase from Vasconcellea quercifolia A.St. Hil. Latex Displaying Higher Substrate Specifity”. J. Agric. Food. Chem., 58, 1102711035.
Figura 1: Actividad depilante, microscopía electrónica de barrido, vista superficial (200x).
Conclusiones
Extractos proteolíticos obtenidos a partir de frutos de especies de la familia Bromeliaceae: Bromelia balansae (Bb), B. hieronymi (Bh) y Pseudananas macrodontes (Pm) fueron caracterizados respecto a su actividad frente a sustratos representativo de la piel: Bb, Bh y Pm mostraron actividad frente a colágeno, keratina y epidermis. Estas características permiten
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