NANOVEHÍCULOS DEL ÁCIDO 5-AMINOLEVULÍNICO (ALA) EN EL TRATAMIENTO FOTODINÁMICO DEL CÁNCER
J. Morrone (1), R. Gauna (1), V. Zannoni (1), G. Gola (2), G. Di Venosa(3), J. A. Ramírez (2), A. Casas(3), V.Defain(1) (1) INTI Química, (2) Departamento de Química Orgánica de la FCEN, UBA, (3) Centro de Investigación sobre Porfirinas y
Porfirias, CIPYP-CONICET
mvdt@inti.gob.ar
Introducción
La luz puede ser empleada para el tratamiento
de tumores superficiales o de acceso por vía
endoscópica por medio de la Terapia
Fotodinámica (TFD). Se basa en el uso de
fotosensibilizantes que al ser expuestos a la luz
dan lugar a una serie de reacciones
fotoquímicas. De esta manera, pueden
destruirse selectivamente las células
fotosensibilizadas.
Un fotosensibilizante endógeno importante es
la Protoporfirina IX (PpIX), que se biosintetiza a
partir de su precursor, el ácido 5-
aminolevulínico (ALA). La administración de
ALA en un tejido particular lleva a la
acumulación de porfirinas, que en general es
más pronunciada en células con alta actividad
metabólica, tales como células tumorales.
A)
B)
Figura 1. A) Estructura del ALA. B) Estructura de la Protoporfirina IX
A pesar de que el uso de ALA en TFD ha mostrado un gran potencial para tratamientos de células tumorales su eficacia se ve limitada por su naturaleza altamente hidrofílica, lo que lleva a una baja penetración en tejidos malignos. A pH fisiológico, el ALA es un zwitterión, lo cual limita su capacidad para atravesar las membranas celulares vía difusión pasiva, y puede resultar en una baja penetración y una distribución en los tejidos blanco no homogénea.
Objetivo
Sintetizar compuestos derivados del ALA
mediante reacciones multicomponentes
aumentando
su
lipofilicidad
y
nanovehiculizarlos para mejorar su penetración
en tejidos malignos blanco.
Descripción
Síntesis de derivados de ALA (dALA) El Esquema 1 muestra como el ALA, con el grupo amino protegido, participa de una reacción de Passerini de 3 componentes (P3CR) para generar un intermediario cuya
posterior hidrogenación produce el derivado buscado. El componente carbonílico empleado en la P-3CR es formaldehído, cuya alta reactividad evita que el grupo ceto del ALA interfiera en la reacción, y al mismo tiempo forma el enlace éster requerido.
O
+ R1 N C + Cbz N
H
H
H
O1
O
P-3CR Cbz
OH
N H
O
Ester O O
H N
R1 O
desprotección
O
H
N
H2N
O
R1
O
O
Esquema 1. Reacciones de Passerini con posterior
desprotección para la síntesis de derivados de ALA
Mediante esta secuencia se pudo preparar una familia de derivados con distintos sustituyentes R1, que fueron evaluados in vitro para estudiar su actividad como prodrogas de ALA. En la Tabla 1 figuran los compuestos obtenidos. Todos promovieron la biosíntesis de protopofirina. Entre ellos se destaca el compuesto 2-((4-fluorofenil) amino)-2-oxoetil-5aminolevulinato (1P). Los compuestos se caracterizaron por 1H-RMN y 13C-RMN, y EM de alta resolución.
Tabla 1: Compuestos dALA sintetizados.
Compuesto Log D
Estructura
pfluorofenilALA (1P)
-0,36
CiclohexilALA (2P)
-0,72
ALA
-3,37
Nota: Log D es el coeficiente de distribución
Preparación de los nanovehículos
Se evaluó la preparación de dos tipos de
nanovehículos:
Carriers
lipídicos
nanoestructurados (NLC) y liposomas
ultradeformables (LUDs).
Para la preparación de NLC, se estudió la
solubilidad de los compuestos obtenidos en
diferentes lípidos, entre ellos, ácido láurico,
alcohol cetílitico, ácido oleico y oleato de
glicerilo. No se logró solubilizar ningún derivado
de ALA en los lípidos disponibles. En
consecuencia, se propuso la encapsulación de
estos derivados de ALA en LUDs.
Los LUDs fueron preparados de acuerdo al método de hidratación de la película delgada empleando fosfatidilcolina de soja y colato de sodio. Se hidrataron con solución 60 mM de cada derivado de ALA en NaCl 0.9% p/v, con agitación magnética. Los liposomas multilamelares resultantes se extruyeron a través de membranas de poro definido de 0,1 µm. Dicha extrusión se realizó con un extrusor manual. De la misma manera se prepararon LUDs sin derivados (LUDs Blanco) como control. Los LUDs cargados se separaron de la droga libre por columna de exclusión molecular con Sephadex® G-50 medium. Caracterización fisicoquímica de los LUDs Las suspensiones de LUDs obtenidas se caracterizaron mediante la distribución de tamaño de partícula (Z-Ave) y el índice de polidispersidad (PdI) por dispersión dinámica de luz. El potencial Z se determinó por análisis en fase de scattering de luz (PALS, del inglés phaseanalysis light scattering). Para la determinación de la concentración de LUDs en los eluatos de la columna se realizó la cuantificación de fosfatos mediante la reacción colorimétrica de Böttcher. La eficiencia de encapsulación (%EEp/p) se determinó en las fracciones eluídas que contenían fosfolípidos por cuantificación del ALA y los derivados del ALA mediante la reacción colorimétrica de Ehrlich. Evaluación in vitro de los LUDs La producción de porfirinas se evaluó empleando como modelo la línea celular de adenocarcinoma mamario murino (LM2). Se incubaron las células con los distintos compuestos, y al cabo de 3 h se realizó la extracción y cuantificación de porfirinas por extracción en HCl 5%. Luego se cuantificó fluorométricamente (excitación: 406 nm; emisión: 604 nm). Se utilizó PpIX (Porphyrin Products, Logan, Utah, USA) como estándar de referencia.
Resultados
Como puede observarse en la Tabla 2, la distribución de tamaño de partícula de los LUDs obtenidos fue la esperada, con un diámetro medio (ZAve) menor a 120 nm en todos los casos y un índice de polidispersidad (PDI) menor a 0,2. Mientras que el potencial Z cercano a 0 mV se correlaciona con una baja estabilidad física de los LUDs en suspensión. El compuesto 1 P presenta la mayor eficiencia de encapsulación (%EE) que se correlaciona con su mayor lipofilicidad (mayor log D) permitiendo su mayor retención en la bicapa lipídica (Tabla 2).
Tabla 2: Caracterización fisicoquímica de los
LUDs
LUDs
[Fosfato] %EE
mM
p/p
Z-Ave nm
PdI
Pot ZmV
LUDs blanco
45,8
-
114 (1)
0,152 (0,014)
-24 (6)
LUDs ALA
2,4
4,5
91 (2)
0,118 (0,003)
-4 (5)
LUDs 1P
8,6
6,9
120 (2)
0,084 (0,013)
-3 (5)
LUDs 2P
6,8
2,7
106 (2)
0,149 (0,008)
-4 (6)
Nota: Los resultados indicados entre paréntesis
corresponden al desvió estándar de la medición.
En la tabla 3, se observan los resultados de producción de porfirinas obtenidos en la evaluación in vitro tanto de ALA como de los dALA. La viabilidad por MTT fue de 100% para 1P-ALA LUDs, 2P-ALA LUDs y ALA-LUDs a la concentración más alta (0.6 mM). La producción de porfirinas fue mayor en los estudios con ALA y sus dALA libres que en los LUDs. Esto podría deberse a una inducción en la liberación de las porfirinas al medio extra celular producto del alto contenido lipídico en el citoplasma o por una liberación deficiente del contenido de los LUDs.
Tabla 3: Evaluación in vitro de los LUDs
[mM] ALA dALA
ALA libre
2P libre
1P libre
LUDs ALA
LUDs 2P
0
20 20 20
19
20
0,1
53 83 61
49
49
0,3
78 72 76
48
55
0,6
77 73 73
45
48
LUDs 1P
21 53 47 49
Conclusiones
En este trabajo se lograron sintetizar dos derivados de ALA mediante una reacción de Passerini seguida de hidrogenación. Estos derivados fueron obtenidos mediante el desarrollo de una nueva ruta de síntesis partiendo de ácido levulínico. Los derivados obtenidos se pudieron encapsular en LUDs. Dado que en la línea celular estudiada con LUDs hubo menor producción de porfirinas se evaluará en otras líneas celulares. Además, se emplearán modelos in vivo para estudiar la permeación transdérmica. En futuros abordajes experimentales se probarán nuevos derivados de ALA con mayor liposolubilidad para ser vehiculizados en NLC con el objeto de desarrollar formulaciones de aplicación tópica.
Bibliografía
M. Kaliszewski et al. Biological activity of 5-aminolevulinic acid and its metil ester alter storage under different conditions, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 87 (2007) 67-72. Q. Peng, T. Warloe, J. Moan, H. Heyerdahl, H. B. Steen, J. M. Nesland and K.-E. Giercksky, Photochem. Photobiol., 2008, 62, 906–913. G. Di Venosa et al. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 96 (2009) 152–158.
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