COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE EFECTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN PELÍCULAS PLÁSTICAS
Cancela E1, Matos L1, Fiszman G1, Eisenberg P2, Blanco Massani M2*
(1) INTI Biotecnología Industrial (2) INTI Plásticos,
*blanco@inti.gob.ar
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
Luego de incubar las placas durante 20 h a 36
Mientras la investigación avanza en el campo
± 2 °C en estufa se evaluó la aparición de halos
de los materiales activos, muchos polímeros
de inhibición del crecimiento bacteriano.
con actividad antimicrobiana muestran
El ensayo fue realizado en dos experimentos
aplicaciones comerciales promisorias; sin
independientes por triplicado.
embargo, la metodología para evaluar su
Método cuantitativo. El procedimiento
efectividad es muy variada, resultando difícil
utilizado se basó en la norma ASTM E2149 [2]
llevar a cabo análisis comparativos unificados.
con algunas modificaciones. S. aureus ATCC
Si bien existen métodos cuantitativos
25923 y E. coli ATCC 25922 se cultivaron por
normalizados, su aplicación en la determinación de la actividad antimicrobiana
separado (18 hs a 28ºC) y se formularon inóculos iniciales de 105 unidades formadoras
resulta compleja cuando se requieren ensayar
de colonias por mililitro (UFC/ml) en solución
muchas películas simultáneamente. En
fisiológica. El inóculo inicial de cada
contraste, los métodos semi-cuantitativos más
microorganismo fue incubado a temperatura
sencillos ofrecen resultados subjetivos.
ambiente y en agitación con 5 discos de cada
En este trabajo se analizaron dos estrategias
una de las muestras plásticas (P y L),
metodológicas con el fin de determinar la actividad antimicrobiana en plásticos. Para ello,
manteniendo la relación área de muestra/inóculo (25.8 cm2/105 UFC/ml)
se
evaluaron
películas
plásticas
referenciada en la norma ASTM E2149. Luego
antimicrobianas utilizando un método de
de 1 hora de incubación se realizaron los
difusión y uno de recuento en placa
plaqueos para llevar a cabo el recuento de
(adaptación de la norma ASTM E2149).
colonias correspondiente a la muestra activa
DESCRIPCIÓN
Muestras plásticas Se ensayaron dos películas de polietileno, la película P, adicionada con un agente biocida (mineral de silicio modificado con ión plata (Ag+)) y la película L (un control sin actividad antimicrobiana). En ambos casos las muestras se procesaron cortando discos de un diámetro de 0,5 mm. Todas las muestras fueron esterilizadas de ambos lados con luz UV (15’ cada lado) (Philips germicida 15W) y se mantuvieron en condiciones estériles hasta el
(P) y el control sin agente biocida (L). Los resultados se compararon e informaron como reducción del crecimiento de las variables transformadas logarítmicamente. Tratamiento estadístico. Los valores de recuento se informaron como log10 ± la incertidumbre asociada al método de recuento de colonias. El cálculo de incertidumbre se llevó a cabo sobre las variables transformadas logarítmicamente (log10 UFC/ml) según la ecuación 1
(1) U 2SR
momento de su uso.
Siendo SR la desviación de reproducibilidad
Microorganismos
obtenida como el promedio de las diferencias
-Staphylococcus aureus (ATCC 25923) como
cuadráticas de resultados entre series de
representante del grupo de las bacterias Gram
placas inoculadas en condiciones de
positivas.
reproducibilidad [3]. La incertidumbre
-Escherichia coli (ATCC 25922) como
expandida para cada microorganismo resulta:
representante del grupo de las bacterias Gram
U (S. aureus) = 0,28 log10 UFC/ml
negativas.
U (E. coli) = 0.21 log 10 UFC/ml
Evaluación de la actividad antimicrobiana
La comparación entre pares se realizó por la
en plásticos
prueba T, utilizando el Software libre para
Método cualitativo. Se utilizó el método de
análisis estadístico PaSt [4]
difusión en agar [1]. Se sembraron placas de
medio mínimo Luria Bertani (LB) (Britania) agar
semisólido con 100 μl de cultivos overnight de
los
microorganismos
previamente
mencionados. Sobre la superficie de las placas
se colocaron los discos correspondientes a
cada una de las muestras a evaluar. Se incluyó
un disco (C) impregnado con cloranfenicol (50
μg/disco) como control positivo de inhibición.
RESULTADOS
Los resultados de la evaluación de la actividad antimicrobiana en plástico utilizando el método cualitativo se muestran en la Figura 1. Se observó la presencia de áreas oscuras (sin crecimiento) en las placas sembradas con S. aureus ATCC 25923 tanto para el disco C conteniendo cloranfenicol como para la película
P (Fig. 1a), mientras que no se observó inhibición debida a la película L (sin antimicrobiano). Ninguna de las películas plásticas ensayadas presentó inhibición frente a E. coli ATCC 25922, obteniéndose actividad antimicrobiana solo para el control con cloranfenicol (Fig. 1b).
Figura 1. Evaluación de la actividad antimicrobiana por el método cualitativo frente a (a) S. aureus ATCC 25923 (b) E. coli ATCC 25922. C: disco con Cloranfenicol (50 μg/disco); L: película plástica; P: película plástica con agente biocida.
Los métodos de determinación de actividad antimicrobiana a través de la evaluación de zonas de inhibición involucran la difusión del agente antimicrobiano en el medio de cultivo a partir de un sustrato, y la inhibición del crecimiento por la presencia del antimicrobiano en una concentración que excede la concentración mínima inhibitoria (CIM) para ese antimicrobiano frente al microorganismo sensible [5]. Los resultados obtenidos por el método de difusión en agar sugieren que el agente antimicrobiano presente en el plástico activo (P) se encontraría por debajo de la CIM necesaria para inhibir el crecimiento de E. coli ATCC 25922, resultando sólo efectivo frente a S. aureus ATCC 25923. El método cuantitativo basado en la norma ASTM E2149 permitió cuantificar la viabilidad de los microorganismos luego de estar en contacto con las películas plásticas. Para el recuento de S. aureus ATCC 25923 se observaron diferencias significativas (P<0,05) cuando la bacteria se incubó en presencia de la película activa (P) respecto al control sin agente biocida (L), obteniéndose una reducción del crecimiento de 3,19 unidades logarítmicas (Tabla 1). Para E. coli ATCC 25922, en cambio, no se observaron diferencias significativas (P≥0,05) en el recuento obtenido en presencia de la película activa y el control sin agente biocida (Tabla 1).
Tabla 1. Recuento de microorganismos luego de ser incubados en presencia de las películas plásticas.
Microorganismo sensible
Recuento bacteriano (log10 UFC/ml)
Película P Película L
S. aureus ATCC 25923 3.19 ± 0,28a -*
E. coli ATCC 25922
3.82 ± 0.21b 3.90 ± 0.21b
* Recuento menor que 30 UFC/ml a-b letras diferentes indican diferencias significativas entre valores (P<0,05)
Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos mediante el método cualitativo, confirmando que la cantidad de biocida presente en el plástico resultaría eficiente para la inhibición de S. aureus e insuficiente para inhibir el crecimiento de E. coli. La diferencia en la suceptibilidad al agente activo podría estar relacionada con la estructura diferencial entre la pared celular de Gram negativas respecto a las Gram positivas. El método cuantitativo además, podría utilizarse para determinar el efecto del tiempo de exposición del microorganismo al agente antimicrobiano presente en el plástico. Asimismo, dado que el método cuantitativo permitió evaluar la reducción en la viabilidad de los microorganismos expuestos al agente antimicrobiano, consideramos a éste como el método más apropiado para la evaluación de efectividad de matrices plásticas aditivadas con agentes biocidas. Por otro lado, el método cualitativo permitió evaluar de forma rápida y sencilla la presencia o ausencia de actividad biocida en un plástico por la presencia o ausencia de inhibición del crecimiento del microorganismo sensible, esto permitiría utilizar el método para controles de calidad de plásticos activos rápidos. Conclusión
El presente trabajo permitió poner a punto un método cualitativo y uno cuantitativo para determinar la actividad antimicrobiana en plásticos. El análisis de los resultados mostró que ambos métodos aportan información complementaria. Mientras el método de difusión en agar resultó ser más sencillo que la adaptación de la norma ASTM, este último permitió calcular la reducción del crecimiento de los microorganismos sensibles. A partir de los resultados evaluados concluimos que el método de difusión (cualitativo) podría ser utilizado para la evaluación rápida (y a bajo costo) de múltiples películas (empleado usualmente para la determinación de la CIM); mientras que el método de recuento (cuantitativo) permitiría cuantificar el efecto antimicrobiano específico, siendo más apropiado para la evaluación de efectividad de polímeros aditivados con agentes biocidas. Asimismo, destacamos la participación del INTI en el desarrollo de técnicas cuyo objetivo principal es dar respaldo científico-tecnológico a las innovaciones industriales de la región.
REFERENCIAS
1. Blanco Massani, y col. (2008) Food addit contam 25, 1424–1430
2. ATMS E2149-10 ASTM International standard (2010). 3. ISO/TS 19036 4. Hammer y col (2001). Palaeontologia Electronica 4 9. 5. Green y col (2011). Biointerphases 6 13. 6. Cowan y col (2003) J Ind Microbiol Biotechnol 30 10.
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