TRAZABILIDAD DE CULTIVOS MICROBIANOS DE REFERENCIA AUTÓCTONOS
Gladys M. Mastromonaco1; Graciela O. Davel2; Marta G. Mazza3; Mariana Mazza2; Cristina Rivas2; María Eugenia Bosco Borgeat2; Nicolás Refojo2.
INTI SAI1 , Departamento Micología. Instituto Nacional de Enfermedades infecciosas2; Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos3 de la Administración Nacional de Laboratorios e
Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán” gmm@inti.gob.ar
INTRODUCCIÓN Los cultivos microbianos de referencia (CR) son imprescindibles en los procesos de Control de Calidad Interno y como ítems de ensayo en los ejercicios interlaboratorios. Los cultivos foráneos, considerados de referencia, pueden dar resultados no esperados por no ser representativos de la microflora de la región.
OBJETIVO Producir CR a partir de un panel de cultivos autóctonos correctamente caracterizados, homogéneos, estables y trazables, utilizando procedimientos estandarizados y normalizados (norma IRAM 14950 vigente).
DESCRIPCIÓN Los representantes de las instituciones involucradas definieron y establecieron el proceso y acordaron los criterios para la producción de cultivos de origen clínico. El panel de cultivos de levaduras autóctonas seleccionadas está conformado por: Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, Cryptococcus neoformans y C. gattii obtenidos de la colección de cultivos del Departamento de Micología – ANLIS. Las especies fueron identificadas por el método de referencia de Kurtzman et al. (2011) y la secuenciación de la región ITS1-5.8S-ITS2. Las secuencias obtenidas se compararon con las bases de datos públicas del Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS).
Cada cultivo se multiplicó y se inoculó en 600 discos de papel whatman Nº1; se secaron y envasaron tres discos por viales estériles de tapa a rosca, generando un total de 200 viales como se muestra en la figura 1.
En los ensayos de homogeneidad (H) se verificaron las características morfológicas y el desarrollo en medios de cultivo diferenciales sobre un número de viales seleccionados en forma aleatoria y definido por la fórmula 3x3 n°v (n°v = al número de viales del lote de producción). Para este estudio se evaluaron 36 discos los que se obtuvieron tomando 2 discos de cada vial, sobre un total de 18 viales (figura 2).
La estabilidad (E) a corto y largo plazo de las propiedades de interés de cada especie se determinó sobre el grupo de viales seleccionados al azar. Para la estabilidad a corto plazo se tomaron 10 viales conservados a diferentes tiempos y temperaturas y 12 para la estabilidad a largo plazo. Finalmente se evaluaron 2 discos los que fueron extraídos al azar de los viales reservados para cada temperatura (figura 2).
Figura 1: viales de discos inoculados con la cepa en estudio.
Donde X corresponde a 1 disco tomado de 1 vial
Figura 2: criterio adoptado par el estudio de homogeneidad y estabilidad.
RESULTADOS Evaluación de la Homogeneidad
El 100% de los discos evaluados respondieron a los requisitos de viabilidad, pureza e identidad por lo tanto se los considera homogéneos.
Evaluación de la Estabilidad a corto plazo:
El 100 % de los discos ensayados de todos los discos almacenados a -70ºC y 4ºC cumplieron con los requisitos de Viabilidad, Pureza e Identidad luego de 14 días de almacenamiento.
C. tropicalis, C. glabrata solo sobrevivieron 7 días a 28ºC y 37ºC, mientras que el 100% de los discos controlados de C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, Cr. gattii Cr. neoformans cumplieron con los requisitos de Viabilidad, Pureza e Identidad luego de 14 días de almacenamiento a estas temperaturas.
Como era de esperar, ninguno de los CR pudo sobrevivir 7 días a 55ºC.
Evaluación de la Estabilidad a largo plazo:
En el Tabla 1 se resumen los resultados obtenidos para cada una de las cepas evaluadas en los distintos plazos de almacenamiento y condiciones de temperatura.
Tabla 1: Ensayos de estabilidad a largo plazo
CEPA
C. glabrata C. tropicalis C. krusei C. parapsilosis C. albicans C. gattii
C. neoformans
Nº DMic
113884 113920 134341 113911 113874 073122
083456
Porcentaje de discos ensayados que cumplen con los requisitos de
viabilidad, pureza e identidad a distintos tiempos de almacenamiento
4ºC
-20ºC
28ºC
0% luego de un mes
100% luego de
doce meses,
y continúan
en evaluación
100% luego de
seis meses,
y continúan
en evaluación
0% luego de seis meses
100% luego de
seis meses,
y continúan
en evaluación
CONCLUSION
El panel de cultivos autóctonos fue caracterizado utilizando dos métodos definidos lo que permitió confirmar la identidad de las cepas. La caracterización se realizó a nivel de género y especie, cumpliendo con las propiedades cualitativas descriptas taxonómicamente.
Los lotes producidos fueron Homogéneos y Estables por 12 meses a 4ºC y al menos durante seis meses a -20ºC. La utilización de esta metodología de producción y evaluación resultó adecuada para la producción de CR, y sirve de base para la producción de CR de otras especies de microorganismos.
Un cultivo microbiano se considera trazable cuando sus propiedades cualitativas son establecidas por consenso entre los expertos, y están descriptas por su taxonomía.
Demostrar la trazabilidad a nivel internacional de cultivos autóctonos -que responden a las propiedades y características de la región de origen-, establecerá la equivalencia de los mismos con cepas de otras colecciones. Además, el uso de aquéllos permitirá prescindir del ingreso de cultivos foráneos, los cuales pueden dañar la flora natural, o generar focos de enfermedades y afectar a la ecología regional.
BIBLIOGRAFÍA Kurtzman C. P. Fell, J. W. Boekhout, T. The Yeast, a Taxonomic Study 2011 Elsevier Science Publisher B. V. Amsterdam 5th edition
Norma IRAM 14950 Cultivos microbianos de referencia –Requisitos para la competencia de los productores de cultivos microbianos de referencia
Ver+/-
