GÉNERO LISTERIA EN PRODUCTOS CÁRNICOS: MÉTODOS MOLECULARES PARA SU DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN
Lell M, Epifane E, Cañete VA, Cuesta AI, Malis JE INTI Carnes
acuesta@inti.gob.ar
INTRODUCCIÓN
El género Listeria agrupa microorganismos cuyas características son bacilos Gram positivos, no esporulados, aerobios-anaerobios facultativos. Numerosas especies pertenecen al género Listeria: Listeria innocua, L. welshimeri, L.seeligeri, L. ivanovii, L. grayi y L. monocytogenes; sólo esta última es patógena para el hombre. Listeria monocytogenes es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su presencia en los alimentos está determinada por su extensa distribución en el ambiente tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la producción de alimentos - lo que confiere una importante oportunidad para contaminarlos. El control y detección de este microorganismo patógeno forma parte de sistemas de calidad como el Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC o HACCP) y monitoreo de inocuidad por SENASA.
OBJETIVO
Evaluar las características de métodos moleculares aplicados en la confirmación de aislamientos sospechosos de género Listeria y/o Listeria monocytogenes provenientes de muestras de salazones crudas y cocidas.
DESCRIPCIÓN
El laboratorio de microbiología de INTI-Carnes está trabajando en la implementación de metodologías para detección de patógenos en productos cárnicos, en particular se están validando métodos para detección e identificación de patógenos según metodologías ISO y USDA. (Figura 1 y 2)
Con la finalidad de evaluar métodos moleculares para identificar Listeria monocytogenes y género Listeria, se realizaron en paralelo el método de USDA (referencia 3) y métodos moleculares (referencia 1 y 2) para identificación de género y especie para muestras de salazones crudas y cocidas.
Los aislamientos obtenidos a partir de matrices cárnicas provenientes de 49 muestras de
salazones crudas y cocidas se han evaluado mediante la identificación de genes empleando cebadores prs F /prs R para género Listeria (1) y cebadores Lip1 F1/ Lip2 R1 para Listeria monocytogenes (Jofré et al.2005 referencia (2). (Tabla 1)
En todos los casos, se realizaron controles empleando material de referencia microbiológico: Listeria monocytogenes ATCC 19114, Listeria ivanovii ATCC 19119 y Listeria innocua ATCC 33090.
Tabla 1: Cebadores y amplicones específicos de género Listeria y Listeria monocytogenes.
Gen Secuencia Amplicon Especificidad r
target
de
(pb)
e
cebadores
f
(5´-3´)
prs F GCTGAAGA GATTGCGA AAGAAG
370 prs R CAAAGAAA
CCTTGGAT TTGCGG
Género Listeria 1 Género Listeria 1
Lip1 F1 GATACAGA
Listeria
2
AACATCGG
monocytogenes
TTGGC
406
Lip2R1 GTGTAACT
Listeria
2
TGATGCCA
monocytogenes
TCAGG
Figura 1: Laboratorio INTI-Carnes.
Figura 2: Salazones crudas.
RESULTADOS
Los productos de la amplificación se revelaron mediante Electroforesis en gel de agarosa (Figura 3).
M1 2 3 4
1000 900 800 700 600 500 400
300
200
100
Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa conteniendo amplicones de 370-bp correspondiente al gen prs. Calle M: Marcador de peso molecular (100bp Marker); Calle 1: Listeria innocua ATCC 33090; Calle 2: control de reactivos; Calle 3: aislamiento Listeria innocua; Calle 4: aislamiento Listeria innocua.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2. En todos los casos para Listeria innocua se detectó el gen prs y no se detectó el gen Lip.
Tabla 2: Resultados obtenidos para los aislamientos que
presentaron enegrecimiento del Fraser y Mox mediantes
método de referencia (USDA) y metodologias moleculares.
Cantidad
Resultados Resultados Resultados
Aislamientos
evaluados positivos
positivos
positivos
Método (1) Método (2) USDA (3)
Listeria
0
-
-
-
monocytogenes
Listeria ivanovii
0
-
-
-
Listeria innocua
7
7
0
0
Listeria
0
-
-
-
welshimeri
Listeria
0
-
-
-
seeligeri
géneros Bacillus/
2
0
0
0
Clostridium
géneros
8
0
0
0
Enterococcus/
Streptococcus
Lmonocytogenes
1
1
1
1
ATCC 19114
Listeria ivanovii
1
1
0
0
ATCC 19119
Listeria innocua
1
1
0
0
ATCC 33090
CONCLUSIONES Estos resultados preliminares indican que la PCR es especialmente útil en el análisis para investigación de Listeria monocytogenes en salazones por su gran sensibilidad y su alta especificidad. Cobra importancia este método alternativo y complementario de identificación debido a la dificultad de diferenciar aislamientos de Listeria monocytogenes y Listeria innocua.
BIBLIOGRAFÍA
(1) Doumith M, Buchrieser C, Glaser P, Jacquet C, Martin P. Differentiation of the Major Listeria monocytogenes Serovars by Multiplex PCR Journal of clinical microbiology; 2004 : 3819– 3822.
(2) Jofre A, Martina B, Garrigaa M, Hugasa M, Plab M, Rodrıguez-L!azarob D, T. Aymerich T Simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella by multiplex PCR in cooked ham. Food Microbiology; 2005 (22):109–115.
(3) United States Department of Agriculture (USDA) Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from Red Meat, Poultry and Egg Products, and Environmental Samples MLG 8.09; 05/01/2013.
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