ESTUDIO SOBRE LA CAPACIDAD DE FORMACIÓN DE BIOFILMS EN BACTERIAS DEL SUELO Análisis de Microorganismos de Referencia
A. Supanitsky1, D. Russo2, N. Vozza2, A. Zorreguieta2 1INTI Centro de Celulosa y Papel, 2 Fundación Instituto Leloir
asupanit@inti.gob.ar,
INTRODUCCIÓN Los biofilms ó biopelículas bacterianos son comunidades de bacterias intercomunicadas, que crecen embebidas en una matriz de exopolisacáridos adheridos a una superficie inerte ó a un tejido vivo. El crecimiento en biofilm está directamente relacionado con las condiciones del ambiente. El estudio de la adherencia de los microorganismos a las distintas superficies, tanto bióticas como abióticas, es central ya que ésta condiciona la formación de biofilm, con sus consecuencias en el área industrial (contaminación de un sistema por la actividad microbiana del biofilm) y del medio ambiente (biofertilización, biorremediación y tratamiento de efluentes)
OBJETIVO Como objetivo general del trabajo buscamos correlacionar la capacidad de formar biofilms en bacterias del suelo, con su aptitud en el medio ambiente. En el presente trabajo estudiamos como primera aproximación, la capacidad formadora de biofilms de cepas de referencia sobre una superficie abiótica (poliestireno), variando distintas condiciones de cultivo in vitro, para luego abordar el estudio de aislamientos autóctonos de bacterias provenientes de suelos sometidos a distintas prácticas agrícolas de nuestro país.
DESCRIPCIÓN De especial interés agrícola resulta el estudio de biofilms de rizobios, simbiontes de leguminosas, por su capacidad fijadora de Nitrógeno atmosférico, tanto como de otras rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR). Se estudiaron las siguientes cepas de referencia: Bradyrhizobium japonicum USDA 138 (simbionte de soja) Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (simbionte de soja) Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5080 (simbionte de soja) Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 (simbionte de soja) Mesorhizobium loti Ayac 1BII (simbionte de Lotus spp.) Mesorhizobium loti MAFF 303099 (simbionte de Lotus spp) Rhizobium leguminosarum A34 (simbionte de arveja)
Rhizobium leguminosarum 3841 (simbionte de arveja) Sinorhizobium meliloti Rm 1021 (simbionte de alfalfa) Sinorhizobium meliloti Rm 2011 (simbionte de alfalfa) Pseudomonas fluorescens P1 (PGPR) Pseudomonas fluorescens P2 (PGPR) Burkholderia vietnamensis (BCC) GV Burkholderia Cepacia Genomovar
Se cuantificó la formación de biofilm mediante ensayo en microplacas de poliestireno y tinción con Cristal Violeta. Dicho ensayo se realizó variando distintas condiciones: medio de cultivo (ricos como LB- TY y diferentes medios mínimos), cultivo estático ó en agitación, densidad de la población inicial, tiempo de incubación. Las bacterias fueron cultivadas a 28º C y 200 rpm, cuando correspondió agitación, partiendo de distintas densidades poblacionales: 0.001, 0.01, 0.1 (DO600nm.). Los tiempos de incubación variaron de acuerdo al tipo de microorganismo (de crecimiento lento ó rápido)
RESULTADOS De los estudios realizados podemos resaltar la condición de cultivo en que cada microorganismo analizado mostró mayor adherencia (Tabla1) Además, pudimos observar la dinámica en la evolución del biofilm y el crecimiento planctónico en los tiempos estudiados para cada situación. Como resultados llamativos encontramos: •Bradyrhizobium japonicum USDA110 forma mayor biofilm conforme se aumenta la densidad de la población inicial de bacterias (ODi dependiente), tanto en condiciones de cultivo estático como en agitación (Fig.1 a 3) •Bradyrhizobium japonicum SEMIA5079 alcanzó el mismo desarrollo, independientemente de la densidad poblacional inicial (ODi independiente), en condiciones de cultivo estático y en agitación. •Sinorhizobium meliloti Rm 1021 desarrolló un máximo de biofilm en todos los tiempos de incubación estudiados (tiempo independiente) a una OD inicial de 0,1 en medio TY, en agitación.
MICROORGANISMO
Bradyrhizobium japonicum USDA 138
Bradyrhizobium japonicum USDA 110
Bradyrhizobium japonicum SEMIA5080
Bradyrhizobium japonicum SEMIA5079 Mesorhizobium loti Ayac
1BII Mesorhizobium loti MAFF
303099 Rhizobium leguminosarum A34 Rhizobium leguminosarum 3841 Sinorhizobium meliloti Rm
1021 Sinorhizobium meliloti Rm
2011 Pseudomonas fluorescens P1
Pseudomonas fluorescens P2
Burkholderia vietnamensis (BCC) GV
Burkholderia Cepacia Genomovar I
MEDIO Y manitol 0,2%
Y manitol 0,2%
Y manitol 0,2%
Y manitol 0,2%
AB sacarosa 0,5%
Y manitol 0,2%
Y manitol 0,2%
Y sacarosa 0,5%
TY
TY M63 glucosa 0,2% CAA 0,5% M63 glucosa 0,2% CAA 0,5% M63 glucosa 0,2% CAA 0,5% M63 glucosa 0,2% CAA 0,5%
Tabla 1
Figura 1: Población inicial 0,001 OD Figura 2: Población inicial 0,01 OD
VARIABLE DE CULTIVO AGITACIÓN ESTÁTICO ODi (600nm)
SI
NO
0,001
TIEMPO 7 días
BIOFILM (OD 595nm)
0,5
NO
SI
0,1
7 días
1,1
SI
NO
0,1
6 días
1,5
SI
NO
0,1
7 días
1,8
SI
NO
0,1
3 días
0,4
SI
NO
0,001
4 días
0,55
SI
NO
0,01
3 días
0,6
SI
NO
0,1
4 días
0,4
SI
NO
0,1
2, 3, y 4 días
2,5
SI
NO
0,1
2 días
2,4
SI
NO
0,01
26 hs
8
NO
SI
0,1
45 hs
0,8
SI
NO
0,001
1 día
0,8
NO
SI
0,1
1 día
0,8
Figura 3: Población inicial 0,1 OD
CONCLUSIONES En términos generales, podemos decir que la capacidad formadora de biofilms varía considerablemente con: 1-la cepa, especie y género de rizobio ensayado 2-las condiciones de cultivo. La agitación mecánica induciría una mayor capacidad de unión a la superficie (poliestireno), situación bastante generalizada dentro de los organismos estudiados. Se observó además que los medios de cultivo mínimos favorecen la formación de biofilm. En el caso de los rizobios de crecimiento lento (Bradyrhizobium), pudimos ver que a tiempos extensos de incubación (10 días), la estructura del biofilm disminuye. Esto puede deberse a que el sistema utilizado, las microplacas, no serían adecuadas para sostener las condiciones óptimas del cultivo. En todos los casos estudiados encontramos alguna condición en la cual las bacterias formaron biofilm en mayor ó menor medida (biofilm como propiedad universal)
-El presente trabajo se enmarca en un proyecto de tesis doctoral centrado en el estudio de biofilms bacterianos. -Cabe destacarse la colaboración permanente de los Centros de Agroalimentos y de Biotecnología Industrial, en especial del Laboratorio de Microbiología de alimentos a través de instalaciones, equipamiento y asistencia en general
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