Salud
OPTIMIZACIÓN Y ESCALADO DE PROCESO DE SÍNTESIS QUÍMICA DE NUEVAS MOLÉCULAS CANDIDATAS A DROGAS PARA HEPATOCARCINOMA
D. Vera(1), M. Ciarlantini(1), J. Bayo(2), E. Fiore(2), L. Gandolfi Donadío(1,5), M. Manzi(3), J. Ramirez(4), G. Mazzolini(2); M.J. Comin(1,5)
dvera@inti.gob.ar (1) Dto. Ingredientes Activos y Biorrefinería-SOIyS-GODTeI-INTI (2) Laboratorio de Terapia Génica, Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral-CONICET (3) Dto. Desarrollo Analítico y Control de Procesos-SOIyS-GODTeI-INTI (4) Dto. Química Orgánica, FCEN-UBA- UMYMFOR-CONICET (5) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
Palabras Clave: Cáncer; Interacciones proteína-proteína; Rac1; Reacción multicomponente de Ugi.
INTRODUCCIÓN
Las interacciones proteína-proteína (IPP) gobiernan tres aspectos claves de la vida celular: el crecimiento, la supervivencia y la diferenciación, y su estudio ha resultado de sumo valor para explicar procesos biológicos complejos y comenzar a entender la relación entre las proteínas y las enfermedades. Las interfaces de las IPP son complejas y diversas, por lo que drogas dirigidas a este tipo de blancos ofrecen mayor selectividad y eficiencia en comparación con las drogas clásicas.
En la búsqueda de nuevas moléculas cuyos blancos moleculares sean proteínas validadas como blancos terapéuticos para el tratamiento del cáncer, se ha señalado a la proteína Rac1 de la familia de las GTPasas como un atractivo blanco molecular, ya que se encuentra hiperactivada en tumores de mama, colonrectal, gástricos, testiculares, pulmonares y cerebrales. Rac1 puede encontrarse en un estado inactivo unido a GDP, o un estado activo unido a GTP. El ciclo entre estos dos estados es regulado por su interacción con los factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs), y con las proteínas aceleradoras de la actividad GTPasa (GAPs).
En este trabajo se presentan los avances en el desarrollo de inhibidores novedosos y más potentes que el compuesto líder, con potencial uso como agentes antitumorales.
OBJETIVOS
Objetivo general. Producir lotes validados de candidatos a drogas para uso en ensayos preclínicos y clínicos. Objetivo específico: Estudiar alternativas sintéticas, seleccionar el proceso más eficiente de síntesis de 1G-55 y escalarlo a cientos de gramos para abastecer estudios preclínicos y clínicos.
DESARROLLO
El derivado 1G-55 se seleccionó como representante más promisorio de una nueva familia de compuestos, derivados de 1A-116. La estrategia general de síntesis de la familia se basó en la reacción multicomponente de Ugi (U4CR), que genera una α-aminoacilamida por condensación de un ácido carboxílico, una amina, un isonitrilo y un compuesto carbonílico (aldehído o cetona) (Fig. 2).
Figura 1: Estructuras de inhibidores desarrollados.
Previamente desarrollamos los compuestos 1A116 y 1D-142 (Fig. 1) selectivos de Rac1 con actividad en modelos animales de cáncer y de fibrosis hepática, inhibiendo la IPP de Rac1 con su activante específico Tiam1 (GEF) [1],[2].
Figura 2: Reacción multicomponente de Ugi (U-4CR) empleada para el diseño de la familia de compuestos.
Esta reacción permite crear diversidad en un único paso de síntesis, a partir del uso de diferentes combinaciones de componentes de partida. En este trabajo se presentan los estudios sintéticos realizados hasta el momento.
Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución – No Comercial – No Derivadas (CC BY-NC-ND)
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RESULTADOS
Inicialmente, se sintetizaron y caracterizaron 13 compuestos novedosos, con una pureza superior a 95%. Los miembros de esta nueva familia fueron evaluados biológicamente en ensayos de proliferación celular en líneas celulares tumorales humanas. Se detectaron 6 compuestos capaces de inhibir la proliferación celular de manera dependiente de la dosis, y con actividad más potente que los inhibidores conocidos hasta el momento (Fig. 3). Se verificó por medio de la tecnología Alpha Screen [3] que estos compuestos inhibieron la interacción entre Rac1 y su GEF Tiam1.
Figura 3: Actividad Antiproliferativa (IC50 [µM]) y resultados Alphascreen de compuestos seleccionados.
Se seleccionó el compuesto 1G-55 por su alta potencia antiproliferativa en cultivos celulares (IC50 2-4 mM) y por su capacidad para inhibir la interacción entre Rac1 y su activante Tiam1.
Las estrategias sintéticas ensayadas para la obtención del compuesto fueron tres, y se representan en la Figura 4.
H2N NH2 S NH2
Br (Boc)2O
NH2 6 Pasos
COOH reactivos comerciales
HH NN
NBoc
1F-123
Ruta 1
O
U-4CR
OH R3 CHO + R4 NH2
R1 NC
R1 NC
reactivos comerciales
R3CHO
R4NH2 O
i) U-4CR ii) H2/Pd(C)
H2N
NO2 OH
R1
O
N
R3
R4
1G-123
H
H
N
N
NBoc
1G-12
R1
NH O
N R3
R4
i) HCl/IPA ii) NaHCO3
H NC
N 1G-158
Ruta 2
R1
H
H
N
N
NH 1G-55
O
N
R3
R4
Ruta 3
HH NN
SO 1D-169
NaOH/MeOH R1
O H
NN
NH
O
N
R3
R4
1G-193
Figura 4: Estrategias sintéticas para obtener 1G-55.
En la Ruta 1, la N,N’-diarilguanidina protegida 1F-123 participa en la reacción U-4CR. El grupo t-butilcarbamato (Boc) protector es removido posteriormente por tratamiento en condiciones ácidas.
Las Rutas 2 y 3 difieren de la primera en que el grupo guanidina se forma en una etapa posterior a la U-4CR. Para tal fin, la Ruta 2 emplea un acoplamiento con cianamida (1G-158), mientras que en la Ruta 3, el acoplamiento es con tiourea (1D-169) en presencia de EDCI, seguida de hidrólisis en medio básico. Estas alternativas requieren un menor número de pasos de reacción, y en el caso de la Ruta 3, el producto pudo ser recristalizado en el mismo medio de
reacción, evitando el uso de columna cromatográfica o el cambio de solvente para la purificación.
Actualmente se está trabajando en la optimización de una ruta de síntesis escalable que permita proveer el candidato 1G-55 con calidad uniforme, estudiando cada paso de las secuencias sintéticas en profundidad para determinar los parámetros claves.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
• Se sintetizaron 13 compuestos, de los cuales 6 mostraron actividad inhibitoria más potente que los compuestos conocidos hasta el momento. Se verificó que el mecanismo de acción es a partir del bloqueo de la IPP entre Rac1 y su GEF, Tiam1. En particular, el candidato 1G-55 resultó ser considerablemente más potente que el compuesto líder. • Se estudiaron 3 alternativas de síntesis seleccionándose la ruta 3 por ser más compatible con el escalado. • Se utilizó esta secuencia para producir un lote a escala 1g el cual está siendo usado para estudios preclínicos para el tratamiento de hepatocarcinoma estudiado. • Se están estudiando distintas estrategias para optimizar las condiciones de reacción de obtención de 1G-55 con el objetivo de lograr un proceso robusto, eficiente, escalable seguro y amigable con el medio ambiente cumpliendo los requerimientos establecidos por la normativa vigente.
Índice TRL: 4
AGRADECIMIENTOS
Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Agencia de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) e Instituto de Calidad Industrial (INCALIN-UNSAM)
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Cardama GA et al. “Preclinical Development of Novel Rac1-GEF Signaling Inhibitors using a Rational Design Approach in Highly Aggressive Breast Cancer Cell Lines”. Anticancer Agents Med. Chem, 14, 2014, 840-851.
[2] Ciarlantini,MS et al. “Development of an Improved Guanidine-Based Rac1 Inhibitor with in vivo Activity against Non-Small Cell Lung Cancer” ChemMedChem, 16 (6), 2021, 1011-1021.
[3] Ullman, E. F et al. “Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91 (12), 1994, 5426–5430.
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