II SIMPOSIO DE RESIDUOS AGROPECUARIOS Y AGROINDUSTRIALES DEL NOA Y CUYO. SAN JUAN, ARGENTINA, 2018
Agregado de valor a un residuo de la industria cárnica
Martínez, M.1, Reñones, L.1, Rodriguez, L.N.1, Majul, L.2, García Mansilla, M.2
1 Laboratorio Farmoquímicos Naturales, Centro de Investigación y Desarrollo de la Industria Química, Instituto Nacional de Tecnología Industrial, Av. General Paz 5445, Buenos Aires, Argentina. 2 Laboratorio de Micología
Experimental – Instituto de Micología y Botánica, Universidad de Buenos Aires-CONICET, Av. Intendente Güiraldes s/n, Pabellón 2, Ciudad Universitaria, Buenos Aires, Argentina. marismar@inti.gob.ar
Introducción
Para la elaboración de embutidos, en la industria cárnica se utilizan tripas diferente tipo. Estas pueden ser de origen natural, artificial o sintético. Las tripas naturales se obtienen a partir del tubo digestivo de cerdos, bovinos, ovinos y equinos. Las artificiales son elaboradas a partir de fibras animales y constituidas por fibras de colágeno. Las sintéticas son elaboradas a partir de sustancias celulósicas o de polímeros de síntesis. Al ser más resistentes y económicas que las de colágeno, estas últimas se utilizan ampliamente en la elaboración de salchichas. Están compuestas principalmente por celulosa regenerada y glicerina como plastificante. La tripa se utiliza para contener temporalmente los ingredientes del producto durante su procesamiento, por lo que, este material posee una alta resistencia, apta para las etapas de elaboración de dichos embutidos, pero esta resistencia dificulta su tratamiento. Si bien en Argentina no hay estadísticas sobre la generación y uso de tripa celulósica, se estima que hay una producción anual de chacinados de 822.000 toneladas, de los cuales el 20% corresponde a salchichas tipo “Viena” [1]. En Estados Unidos, por ejemplo, a principios de siglo, la generación de tripa celulósica rondaba las 1.000 toneladas anuales [2]. En la actualidad, en nuestro país este desecho se descarta, lo que genera grandes cantidades de residuos que son incinerados, desperdiciando su posible reutilización y agregado valor. Con el fin agregar de valor a este desecho denominado tripa agotada (TA), se plantearon dos abordajes independientes: por un lado, tratamientos químicos para la obtención de un producto de interés industrial como el acetato de celulosa y por otro, el empleo de la TA como sustrato de hongos que degradan celulosa de materiales lignocelulósicos, para la obtención de Enzimas Activas sobre Carbohidratos (CAZymes), de gran interés en diversos tipos de industrias.
Materiales y Métodos
Tratamiento Químico Acondicionamiento de la muestra Se partió de la tripa agotada (TA), tal cual se obtiene luego de su utilización en la industria cárnica (Figura 1).
Figura 1. Tripa agotada Este residuo se acondicionó con el fin de eliminar restos provenientes de la preparación de los embutidos y se secó a temperatura ambiente (Figura 2).
Figura 2. Tripa agotada acondicionada (TAa), de aspecto similar a celofán Molienda Para obtener TAa en polvo (TAa/polvo) se probaron dos metodologías para salvar las dificultades de su molienda a temperatura ambiente debidas a las características plásticas del material. En primer término, se molió la TAa con nitrógeno líquido, en segundo término, se realizó una predigestión enzimática. La muestra de TA (tal cual se obtiene luego de su utilización en la industria cárnica) se incubó con
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un blend de lipasas, ajustando el pH entre 5-6 a
40ºC por 2 horas. A continuación, se añadió una
proteasa de origen bacteriano, Alcalasa 2.0
comercial, y se dejó en baño termostático a 40ºC
durante 2 horas, regulando el pH entre 6-7. Luego
se inactivó a 100ºC durante 10 minutos.
Finalmente se incubó a 40ºC durante 5 horas con
endocelulasas fúngicas de origen comercial,
provenientes de Penicillum peniculasum, a pH 5.
Se conservó entre 4-5ºC por 10 días. Se filtró la
TA. Se enjuagó con agua y detergente, y se secó
a temperatura ambiente. Finalmente se molió con
un molinillo a hélice FW-100.
Acetilación
Tanto a TAa como a TAa/polvo se les adicionó
una mezcla de anhídrido acético/ácido fosfórico,
y se calentó durante 4 horas a 70ºC. Luego, se
precipitó el producto en agua destilada, y se
enjuagó hasta pH neutro. Por último, se secó en
estufa de venteo a 105ºC.
Análisis de la estructura química
Se realizó la determinación de la estructura
química del producto mediante resonancia
magnética nuclear de protón (RMN 1H), con
espectrómetro de RMN marca Bruker, modelo
DPX400 equipado con una sonda QNP.
Obtención de CAZymes
Microorganismos
La cepa utilizada para los ensayos de
degradación fue un aislamiento de Peniophora
laxitexta. Los cultivos fueron mantenidos en
medios de cultivo conteniendo extracto de malta
12,7% y glucosa 10%, a 4°C.
Prospección de actividades celulolíticas en medio
agarizado
Se realizaron cultivos en placa de Petri con medio
agarizado conteniendo como medio basal con
micro y macronutrientes, y asparagina como
fuente de nitrógeno. Alternativamente como
fuente de carbono se utilizó carboximetilcelulosa
(CMC) y un cuadrado de 5 x 5 cm de TA. Los
medios de cultivo se inocularon en el centro de la
caja con tacos de 6 mm de diámetro conteniendo
micelio proveniente de colonias en fase de
crecimiento
exponencial.
Para
las
determinaciones se extrajeron alícuotas del
medio agarizado con sacabocados de 6 mm de
diámetro, a los 5, 16 y 26 días de crecimiento. En
los cultivos con única fuente de carbono CMC se
determinó actividad celulolítica de forma
cualitativa revelando halos de degradación del
CMC por tinción diferencial con rojo congo [3].
Evaluación de actividades celulolítica en cultivos
semisumergidos con tripa de celulosa
Se realizaron cultivos semimumergidos utilizando
como medio de cultivo líquido, medio basal
suplementado con 2 fuentes de nitrógeno:
peptona de carne o sulfato de amonio
((NH4)2SO4) y utilizando TAa como única fuente
de carbono.
Condiciones de cultivo
Se utilizaron erlemeyers de 125 ml con 25ml de
medio de cultivo, inoculados con tacos del borde
de colonias crecidas en malta glucosada
agarizada. Los cultivos se incubaron durante 21
días a 28°C en condiciones estáticas de
crecimiento. Los sobrenadantes de cultivos
fueron separados por filtración para posteriores
análisis.
Determinaciones enzimáticas
La actividad β-glucosidasa se determinó usando
como sustrato el reactivo p-nitrofenil- β-D-
glucopiranosido (pNPG) [4]. La cantidad de p-
nitrofenol liberada fue determinada
espectrofotométricamente
midiendo
la
absorbancia del producto de reacción a 430nm.
La actividad β-1,4-endocelulasa se determinó por
medición de azúcares liberados por la
degradación de CMC (carboximetilcelulosa). La
actividad β-1,4-exocelulasa se determinó por
medición de azúcares liberados por la
degradación de celulosa cristalina. La liberación
de azúcares fue cuantificada por medio de
método de Somogyi (1952) [5] y Nelson (1944)
[6].
Se definieron las unidades enzimáticas como la
cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol
de p-nitrofenol (β-glucosidasa) o el equivalente a
1 µmol de glucosa (endo y exocelulasa) por
minuto en las condiciones del ensayo.
En el caso de las determinaciones realizadas a
partir de muestras provenientes de medios
agarizados se reemplazó el volumen de
sobrenadante por las muestras agarizadas y se
expresó la actividad enzimática como U/g de
medio agarizado.
Resultados y Discusión
Tratamiento químico El análisis de RMN-1H muestra la obtención de acetato de celulosa, presentado espectros para el acetato de ambas muestras, con el mismo registro de picos (Figura 3).
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carbono, mostraron la capacidad de la cepa de Peniophora laxitexta para crecer sobre materiales celulósicos. En la figura 5 podemos observar una colonia de P. laxitexta en medio agarizado con CMC como única fuente de carbono a los 5 días de crecimiento. Ésta fue revelada con el colorante rojo congo para evidenciar la degradación del CMC mediante tinción diferencial. Alrededor de la colonia se puede ver un halo de color anaranjado tenue que evidencia la presencia de actividad celulolítica, siendo un resultado cualitativo positivo en todos los cultivos.
Figura 3. Espectro del acetato de celulosa obtenido por RMN-1H
Los picos observados entre 3,6-5,1 ppm corresponden a los hidrógenos unidos a los carbonos de la glucosa, mientras que los observados alrededor de 2,0 ppm corresponden a los hidrógenos del acetilo. Comparando los moles de acetato por unidades de glucosa, se evidencia que el producto obtenido corresponde a una mezcla entre diacetato y triacetato de celulosa. Se observó que el rendimiento obtenido para la muestra TAa/polvo fue mayor al 40%, mientras que para la muestra TA acondicionada, se logró un rendimiento menor al 10%. Pretratamiento enzimático Con el tratamiento con enzimas comerciales, se logró obtener un producto frágil, similar a un polvo blanco; que permitió una fácil molienda (Figura 4). Estos resultados permiten llegar a hidratos de carbono de menor tamaño, optimizando un futuro ataque químico y mejorando el rendimiento de las reacciones.
Figura 4. Tripa tratada enzimáticamente y molida
Obtención de CAZymes Prospección de actividades celulolíticas en medio agarizado Los cultivos realizados en medio agarizado tanto con TAa como CMC como única fuente de
Figura 5. Ensayo cualitativo para revelar actividad celulolítica mediante la técnica de tinción diferencial con rojo congo.
En la Figura 5 se pude observar el halo de degradación de CMC (halos naranjas) y la toma de muestra de medio agarizado dentro de la colonia de Peniophora laxitexta. La Figura 6 muestra la actividad endoglucanasa y exoglucanasa determinada a partir de las muestras de medio agarizado. Los cultivos realizados utilizando CMC como fuente de carbono muestran una mayor actividad exoglucanasa con respecto a la obtenida en los cultivos de tripa de celulosa. En los cultivos en tripa de celulosa se observa una mayor determinación de actividad endoglucansa con respecto a las determinaciones en CMC. Evaluación de actividades celulolítica en fermentaciones semisumergidas con tripa de celulosa Los cultivos semisumergidos de Peniophora laxitexta en TA evidenciaron la colonización del sustrato (TA) por las hifas del microrganismo y su aumento de biomasa. La degradación de TA por P. laxitexta no fue total, quedando parcialmente degradada luego de la cosecha a los 21 días. Los sobrenadantes de cultivo extraídos a los días 14 y 21 de crecimiento (cosecha) mostraron actividad Endocelulasa, Exocelulasa y βglucosidasa como se muestra en la figura 7.
A)
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U n id ad es E n zim áticas (U /g ) 5 16 26
1 .5
1 .0
0 .5
0 .0
T iem p o (D ías)
E ndoglucanasa
E xog lu can a sa
B)
1 .5
U n id ad es E n zim áticas (U /g )
1 .0
0 .5
0 .0
5
16
26
T iem p o (D ías)
E ndoglucanasa
E xog lu can a sa
Figura 6. Actividad celulolítica determinada a partir de muestras de medio basal agarizado de Peniophora laxitexta utilizando como única fuente de carbono A) Carboximetilcelulosa B) Tripa de celulosa acondicionada.
B glucosidasa (U.E. / ml)
4
3.5
3
3.0
2
2.5
1
2.0
0
1.5
Exo-Endoglucanasas (U.E. / ml) (NH4)2SO4
Peptona
B-Glucosidasa
Endoglucanasa Exoglucanasa
Figura 7. Actividad enzimática de los sobrenadantes de cultivo de Peniophora laxitexta
En los tratamientos de cultivo ensayados se puede observar una mayor actividad enzimática cuando se utiliza como fuente de nitrógeno peptona, siendo significativo el aumento de la actividad endoglucanasa y β-Glucosidasa. Esto puede ser debido a que los tratamientos con peptona mostraron un mayor crecimiento aparente sobre la tripa de celulosa y por lo tanto una mayor producción enzimática.
Conclusiones
Mediante el tratamiento químico se logró obtener, acetato de celulosa a partir de la TA, generando valor agregado a un residuo y obteniendo un producto de interés industrial. Los mejores rendimientos se lograron utilizando la TA en polvo, debido a que la molienda en frío aumenta la superficie expuesta del residuo celulósico, favoreciendo el tratamiento de acetilación. El pretratamiento enzimático con celulasas comerciales favoreció la molienda mecánica a temperatura ambiente, No obstante, los altos costos de estas enzimas hacen limitada su aplicación a procesos con productos de alto valor agregado, siendo necesaria la utilización de alternativas más económicas. Respecto al grado de acetilación se continuará con estudios de optimización, a fin de aumentar el rendimiento en este proceso. La TA califica como un excelente desecho celulósico para ser utilizado como materia prima en procesos de fermentación. A pesar de la limitada bibliografía sobre procesos fermentativos de TA, se conoce que los porcentajes de bioconversión del residuo son considerablemente altos. Cepas de Trichoderma resei, alcanzan valores de bioconversión a azúcares simples en fermentadores de 2L cercanos al 90% [7]. Esto es debido a que producen cocteles complejos que contienen Enzimas Activas sobre Carbohidratos (CAZymes), entre las que podemos encontrar actividades como actividades principales endoglucanasas (EC 3.2.1.4), exoglucanasa (EC 3.2.1.58) y β-glucosidasas (EC 3.2.1.21) [8]. La evaluación de actividades celulolítcas en medio agarizado mostró a Peniophora laxitexta como buen candidato para la obtención de cocteles con actividad celulolítica utilizando TA como única como fuente de carbono. Los cultivos semisumergidos de P. laxitexta permitieron obtener cócteles con actividad celulolítica, a partir de la tripa agotada. La mayor producción enzimática se logró al utilizar un
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medio líquido basal suplementado con peptona de carne. Este proceso podría permitir la substitución de las enzimas comerciales por las generadas a partir de la fermentación de hongos, generando una alternativa económica y probablemente rentable a escala industrial. Las alternativas estudiadas representan soluciones ambientalmente amigables al problema de disposición de residuos, con la obtención de productos de alto valor agregado.
Referencias
[1] Costa, A., Brieva, S. (2014). Visión prospectiva de
la cadena de carne porcina al 2030. Ministerio de
Ciencia, Tecnología e Innovación, Buenos Aires.
[2] Sanders, D. A., Belyea, R. L., Taylor, T. A. (2000).
Degradation of spent casings with commercial
cellulases. Bioresource technology. 71(2), 125-131.
[3] Sazci, A., Erenler, K., Radford, A. (1986). Detection
of cellulolytic fungi by using Congo red as an indicator:
a comparative study with the dinitrosalicyclic acid
reagent
method. Journal
of
Applied
Microbiology, 61(6), 559-562.
[4] Wood, T. M., Bhat, K. M. (1988). Methods for
measuring cellulase activities. Methods in Enzymology,
Volume 160, 87–112.
[5] Somogyi MJ. (1952). Notes on sugar determination.
Journal of Biological Chemistry. 195, 19-23.
[6] Nelson NJ. (1944). A photometric adaptation of the
Somogyi method for the determination of glucose.
Journal of Biochemistry. 153, 375-380.
[7] Cumba, H. J., Bellmer, D. (2005). Production of
value-added products from meat processing cellulosic
waste. In 2005 ASAE Annual Meeting (p. 1). American
Society of Agricultural and Biological Engineers.
[8] Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E.,
Coutinho, P. M., Henrissat, B. (2013). The
carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in
2013. Nucleic acids research, 42(D1), D490-D495.
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